王 杰，韩晓彤，董新荣，李 霞*

（湖南农业大学 理学院，湖南 长沙 410128)

连翘[1]（Forsythia suspensa）是木犀科植物连翘属落叶灌木，性寒、味苦，常以果实入药，是中药中最常见的药材之一[2-4]，具有清热解毒、消结散肿、抗菌及抑制真菌等功能[5]，常见的中成药如双黄连口服液、银翘片等制剂均是以连翘果实作为主药[6]。连翘苷和连翘酯苷是中药连翘的主要生物活性组分[7-8]，也是国家药典所规定的连翘质量控制指标性成分[9]（连翘苷含量不少于0.15%）。研究表明，连翘苷和连翘酯苷均具有较好的抗菌和抗病毒作用[10-12]。

研究显示，连翘资源在我国非常丰富，且连翘属植物叶子与果实的成分有较好的一致性，如连翘叶中连翘苷含量远高于连翘果实，含量差别超过40倍[13]。对连翘叶及连翘果实的化学成分分析显示，连翘苷、连翘脂素、齐墩果酸等生物活性成分在叶中含量均高于果实[14]，因此连翘叶具有十分广泛的药用价值。目前人们对于连翘的药用价值主要集中在连翘果上，尚未见关于连翘叶的利用开发，因此对于其研究不仅有利于扩大药源，而且有利于连翘资源的综合开发利用。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

材料：连翘叶原料购于山西省运城市百叶农特产有限公司。

试剂：连翘苷标准品（中国食品药品检定研究院）；乙醇、甲醇均为分析纯。

仪器：UV-2450型紫外分光光度计（日本岛津），DKS24电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 连翘叶中连翘苷的提取方法

称取4.0g干燥的连翘叶粉末，用一定浓度乙醇溶液浸泡0.5h，在一定功率下微波提取一定时间，过滤收集滤液。

1.2.2 连翘苷的检测方法

以连翘苷为标准品绘制标准曲线，采用分光光度法测定。测定标准曲线方程为：A=0.02671x+0.00802（R2=0.99561，n=5）。式中：A为波长229nm 处的吸光度值；x为连翘苷的含量（mg/L）。

1.2.3 单因素试验

准确移取一定体积按1.2.1法提取的滤液，定容后紫外分光光度法检测连翘苷含量。研究乙醇浓度、料液比、提取温度、提取时间、提取功率及提取次数6个因素对连翘苷得率的影响，确定各因素的最佳范围，每个因素重复试验3次，取其平均值。

1.2.4 响应面试验

基于单因素试验结果，采用5因素5水平的Box-Behnken Design（BBD）试验设计[7]，以乙醇浓度（A）、料液比（B）、提取温度（C）、提取时间（D）、微波功率（E）的值为自变量，以连翘苷的得率为因变量，研究响应值以及最佳变量的组合[15]。试验因素水平及编码见表1。整个试验设计在中心点共有27次试验、3个重复，试验分2d随机完成。

表1 响应面试验因素水平及编码Table 1 Factors and levels in the Box-Behnken experimental design

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 乙醇浓度对连翘苷得率的影响

图1 乙醇体积分数对连翘苷得率的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration fraction on forsythin yield

在一定温度、料液比和功率条件下微波提取连翘叶一定时间，考察乙醇浓度对连翘苷得率的影响。由图1可知，随着乙醇浓度的增加，连翘苷得率随之增加。当乙醇浓度到达70%vol以后，连翘苷得率随着浓度增加变化不明显，因此单次提取试验中乙醇浓度选择为70%vol。

2.1.2 料液比对连翘苷得率的影响

在一定温度、乙醇浓度和功率条件下微波提取连翘叶一定时间，考察料液比对连翘苷得率的影响。由图2可知，随着料液比的增加，连翘苷得率随之增加。当料液比为1∶9时，连翘苷得率上升趋势逐渐变缓，结合考虑实际生产的综合成本及生产效率，所以单次提取试验中料液比选1∶9。

图2 料液比对连翘苷得率的影响Fig.2 Effect of material-to-liquid ratio on forsythin yield

2.1.3 提取温度对连翘苷得率的影响

图3 提取温度对连翘苷得率的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on forsythin yield

在一定乙醇浓度、料液比和功率条件下微波提取连翘叶一定时间，考察温度对连翘苷得率的影响。由图3可知，开始时随着温度的增加，连翘苷得率随之增加。当温度到达80℃后，随着温度的增加连翘苷得率呈现出下降趋势，这可能是由于高温导致连翘苷不稳定所致，所以单次提取试验中温度选80℃。

2.1.4 提取时间对连翘苷得率的影响

图4 提取时间对连翘苷得率的影响Fig.4 Effect of extraction time on forsythin yield

在一定温度、乙醇浓度、料液比和功率条件下微波提取连翘叶，考察浸提时间对连翘苷得率的影响。由图4可知，开始时随着提取时间的增加，连翘苷得率随之增加。当提取时间达到7min后，随着提取时间的增加连翘苷得率呈现出下降趋势，这可能是由于时间过长导致连翘苷不稳定，所以单次提取试验中时间选7min。

2.1.5 微波功率对连翘苷得率的影响

图5 微波功率对连翘苷得率的影响Fig.5 Effect of microwave power on forsythin yield

在一定温度、乙醇浓度、料液比条件下微波提取连翘叶一定时间，考察微波功率对连翘苷得率的影响。由图5可知，开始时随着提取功率的增加，连翘苷得率显著升高。当功率到达320W以后，连翘苷得率随功率的增加明显下降，这可能是因为功率过高造成连翘苷不稳定所致，所以单次提取试验中微波功率选择320W。

2.1.6 提取次数对连翘苷得率的影响

表2 提取次数对连翘叶中连翘苷得率的影响Table 2 Effect of extraction times on forsythin yield of leaves of forsythia

在一定温度、乙醇浓度、料液比和一定微波功率条件下提取连翘叶一定时间，考察提取次数对连翘苷得率的影响。由表2可知，连续提取4次以后，Abs的值接近于0，因此不再进行第5次提取。用上述方式提取2次时，连翘苷的累积提取率达到96.67%，此时随着提取次数的增加，连翘苷提取率受到的影响不大，综合考虑提取率及生产成本，提取次数为2次。

2.2 响应面试验

2.2.1 响应面分析方案及试验结果

在单因素试验的基础上，依据BBD的中心组合试验设计原理，确定了5因素5水平的响应面分析法，提取次数均为2次。连翘苷的提取结果见表3。

2.2.2 多元二次响应面回归模型的建立与分析

利用Design-Expert软件对上述回归模型进行方差分析，由表4可知，回归模型的失拟项为0.1021，没有显著性差异；p值为0.0021，表明模型处理间差异极显著。其R2值为0.9670，表明此模型能解释96.70%响应值变化，这表明该模型具有良好的相关性。回归模型各项的方差分析还表明，各因素一次项是显著的，交互项AC、AD、AE和DE，二次项C2、D2、E2都表现为极高的显著性，说明该模型的拟合度好。

表3 响应面设计和连翘苷得率Table 3 Box-Behnken experimental design matrix and corresponding experimental results of forsythin yield

利用Design Expert软件，对试验设计各组合处理得到的连翘苷得率进行二次回归分析，建立多元响应面回归模型。

表4 响应值二次模型的方差分析Table 4 Analysis of variances for the developed response surface quadratic model

图6 乙醇浓度、料液比、温度、时间、功率交互作用对连翘苷得率影响响应面Fig.6 Response surface plots showing the pair wise interactive effects between every two factors including ethanol concentration,material-to-liquid ratio,extraction temperature,extraction time and microwave power

由回归方程经处理得到的乙醇浓度、料液比、提取温度、提取时间和提取功率之间的交互作用对连翘苷得率影响的响应面及其等高线图见图6。其中提取时间和提取功率的交互作用对连翘苷得率的影响最为显著，表现为响应面落差较大，乙醇浓度和提取温度的交互作用次之。其余因素之间的交互作用也表现出较显著的效果。通过对图6的分析可以看出，在此5个因素中，料液比对连翘苷得率的影响最为显著，其余依次为提取功率、乙醇浓度、提取温度和提取时间。此外，各交互因素的最佳作用点基本都落在了试验范围之内，证明此响应面试验设计较为合理。

2.2.3 模型的验证试验

通过连翘苷得率的二次多项数学模型解逆矩阵，得出从连翘叶中提取连翘苷的最佳工艺条件参数为乙醇浓度80%vol，料液比1∶8，提取温度90℃，提取时间5min，提取功率400W，在此条件下，连翘苷最高得率预测值0.2904%。为验证RSA法的可靠性，采用上述最优提取条件进行连翘苷提取试验，重复3次得到连翘苷得率的平均值为0.2864%，与理论预测值相差不大，因此，采用RSA法优化得到的提取条件准确可靠，具有实用价值。

3 结论

应用响应面设计法优化出最佳提取条件：乙醇浓度为80%vol，料液比为1∶8，提取温度为90℃，提取时间为5min，提取功率为400W，在此条件下的连翘苷得率预测为0.2904%。结果表明，利用响应面法优化出的提取工艺模型可以较好的反映出连翘中连翘苷的提取条件，可作为连翘苷的新工艺，为其工业化生产提供技术参考。

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