蒋 丹 丹，王 晗，王 际 辉，叶 淑 红，肖 珊

(大连工业大学 辽宁省食品生物技术重点实验室，辽宁 大连 116034)

0 引 言

近年来，人们在不断地寻求抑制肿瘤的新方法，人参作为我国传统中药受到越来越多的关注[1]。人参的许多生物学活性都是人参皂苷引起的[2]，目前已发现人参皂苷有30多种，其中一些稀有人参皂苷具有极高的生理活性[3]。稀有人参皂苷Compound K是其他二醇型人参皂苷在人肠道内的降解产物，具有良好的抑制癌细胞生长的作用[4]。膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，发病率居泌尿系统恶性肿瘤的首位，具有晚期恶性度加重和易复发的特点[5]。本实验探讨了人参皂苷Compound K诱导细胞凋亡的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料和仪器

人膀胱癌T24细胞系；人参皂苷Compound K，大连工业大学金凤燮教授惠赠；RPMI 1640培养基；新生小牛血清；MTT；caspase－3、caspase－9单克隆抗体；多功能酶标仪(TECAN SUNRISE)；流式细胞仪(Facscalibur Becton Dickinson)。

1.2 细胞培养与传代

将T24细胞置于37℃、5%饱和湿度CO2培养箱中，用RPMI 1640培养液(含10%小牛血清，青霉素100U／mL，链霉素100mg／L)培养。细胞呈单层生长，达80%左右融合时传代，细胞消化采用0.25%的胰蛋白酶和0.02%的EDTA混合消化液，每2～3d传代1次，取对数生长期细胞进行实验。

1.3 MTT法检测细胞活力

取对数生长期细胞，调节细胞浓度为1×104个／mL，接种于96孔板中，同时设立空白对照组。分别培养24、48、72h，换成不含血清培养液，实验组各加入不同浓度的人参皂苷Compound K，使其终浓度分别为5、10、15、20、25μmol／L，每种浓度设4个复孔，继续培养24h，每孔加入5mg／mL MTT溶液100μL，37℃培养4h后弃培养液，加入150μL DMSO，摇床上振荡10min，待甲臜结晶完全溶解后，用酶标仪于570nm处测定每孔光吸收值。

1.4 细胞凋亡的形态学观察

取对数生长期的T24细胞，接种于24孔细胞培养板，同时设立空白对照组。培养24h，加入不同浓度的人参皂苷Compound K，使其终浓度分别为5、10、20μmol／L。继续培养24h，弃培养液，PBS洗涤2次，加入含5μg／mL的Hoechst 33342的RPMI 1640细胞培养液，37℃孵育10min。在荧光显微镜下观察凋亡细胞核的形态变化。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡

利用Annexin V－FITC和PI双染法对细胞凋亡进行检测。取对数生长期的T24细胞，调整细胞密度为5×105个／mL，接种于6孔板内，用浓度分别为5、10、15、20、25μmol／L 人参皂苷Compound K作用24h后收集细胞，同时设立空白对照组，然后利用流式细胞仪对Annexin V－FITC细胞凋亡率进行检测。

1.6 免疫印迹法检测caspase－3和caspase－9蛋白的表达

将传代细胞接种于6孔板内，分别用浓度为5、10、15、20、25μmol／L的人参皂苷 Compound K处理细胞24h，同时设立空白对照组，收集细胞，提取细胞总蛋白。用Bradford法测定含量后，经12%SDS－PAGE处理后转移至PVDF膜上。用体积分数为5%的脱脂奶粉室温封闭1h，分别加1∶1 000稀释的抗人caspase－9、caspase－3抗体，4℃ 孵育过夜，洗膜后加1∶2 000稀释的碱性磷酸酶标记的二抗，室温孵育1h，洗膜后使用ECL试剂进行检测，Bio－Rad凝胶成像图像分析系统照相记录结果。

1.7 统计学处理

用SPSS 10.0软件完成统计学处理，＊P＜0.05表示差异有统计学意义，＊＊P＜0.01表示差异有极显著统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 人参皂苷Compound K对T24细胞存活率的影响

如图1和2所示，人参皂苷Compound K对T24细胞的增殖具有明显的抑制效应。MTT检测结果显示，随着人参皂苷Compound K浓度和作用时间的增加细胞存活率明显下降，呈剂量和时间依赖关系。

2.2 人参皂苷Compound K诱导T24细胞凋亡的形态学

不同浓度人参皂苷Compound K处理T24细胞24h后，如图3所示，荧光显微镜下可观察到明显的凋亡细胞形态，即细胞体积变小，染色质凝集、凋亡小体形成、核内可见致密的颗粒状荧光，并呈剂量依赖关系。对照组则无明显的细胞凋亡特征。

图3 人参皂苷Compound K处理后T24细胞形态观察(荧光显微镜×200)Fig.3 Morphology observation of T24cells treated by ginsenoside Compound K(fluoroscope×200)

2.3 人参皂苷Compound K对T24细胞凋亡的作用

不同浓度人参皂苷Compound K处理T24细胞24h后，收集细胞，用流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果显示，随着人参皂苷Compound K浓度的增加(5、10、15、20、25μmol／L)，细胞凋亡率明显上升，从11.3%(对照组)分别上升至14.2%、16.8%、19.6%、94.3%、95.4%。

2.4 人参皂苷Compound K对T24细胞caspase－3和caspase－9蛋白表达的影响

用不同浓度的人参皂苷Compound K对T24细胞作用24h后，观察caspase－3和caspase－9蛋白表达情况，与对照组比较。从图4可以看出，随着人参皂苷Compound K浓度的增加，与空白对照组相比，蛋白表达变化渐趋明显，caspase－3和caspase－9蛋白表达水平明显增高。

图4 人参皂苷Compound K对T24细胞中caspase－9和caspase－3蛋白表达的影响Fig.4 Effect of Compound K on expression of caspase－9and caspase－3proteins in T24cells

3 结 论

通过研究人参皂苷Compound K对膀胱癌T24细胞的作用发现，人参皂苷Compound K能够抑制T24膀胱癌细胞生长，诱导癌细胞发生凋亡，呈剂量和时间依赖性，其作用机制和caspase蛋白的激活有关。本研究对人参皂苷Compound K应用于临床膀胱癌的治疗提供了实验依据，人参皂苷Compound K有望成为一种具有良好应用前景的抗癌药物。

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[3]李翠翠，庄子瑜，刘廷强，等.转化人参二醇类皂苷为C－K的特异人参皂苷糖苷酶的纯化及性质[J].大连工业大学，2010，29(1)：11－14.(LI Cui－cui，ZHUANG Zi－yu，LIU Ting－qiang，et al.Purification and characterization of the special ginsenosidase transforming protopanaxadiol ginsenosides into ginsenoside C－K[J].Journal of Dalian Polytechnic University，2010，29(1)：11－14.)

[4]李大磊，李延团.人参皂苷CK乳注射液对新西兰兔的长期毒性试验研究[J].中国中医药现代远程教育，2011，9(3)：188－189.

[5]周清，姚善华，韩海彬.预防膀胱癌术后复发的研究进展[J].重庆医学，2011，40(24)：2465－2467.