刘 婷，王立斌，朱永朝，金毅然，李玉奎，魏 军 (宁夏医科大学总医院宁夏人类干细胞研究所，宁夏 银川 750004)

体细胞再程序化的研究主要包括核移植技术、细胞融合技术、利用卵细胞和干细胞的活性因子诱导体细胞的再程序化、基因转导技术这四种技术［1］，但是现行几类再程序化技术均存在诱导效率低、遗传变异高或者依赖病毒转染，无法大批量应用。鉴于此，本研究希望能够建立一种新的应用小鼠早期胚胎活性因子的再程序化技术生成多能干细胞。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料:6～8周龄ICR小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.2 主要仪器及试剂:倒置显微镜、解剖显微镜(Olympus公司)，二氧化碳培养箱(Thermo公司)，PCR仪(Eppendorf公司)，胎牛血清、DMEM、胰蛋白酶、Trizol(Invitrogen公司)，M2培养液、M16培养液(Sigma)，反转录试剂盒(Fermentas公司)，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.3 实验方法

1.3.1 小鼠成纤维细胞的获得与培养:取孕13 d的母鼠，在无菌条件下取出胎鼠，分离背部皮肤，将组织充分剪碎，加入0.125%的胰蛋白酶在4℃消化1 h后，用等量的含FBS的DMEM终止消化，吸取上清液离心。去上清，加培养液，吹打悬浮后以5×105/ml密度接种于培养瓶，在37℃、5%CO2的培养箱中培养。

1.3.2 小鼠体外受精:体外受精及早期胚胎的培养均采用微滴培养法，将受精卵培养至3.5 d囊胚，大量收集冻于-80℃冰箱。

1.3.3 小鼠早期胚胎蛋白的获得:将收集得到的小鼠3.5 d囊胚转移至含有蛋白酶抑制剂的裂解液中超声，12 000 rpm，4℃，离心15 min，取上清，测定蛋白浓度，冻于-80℃冰箱备用。

1.3.4 应用小鼠早期胚胎蛋白……