杨 艳 陈旭冰 陈光勇 刘光明

1.云南省大理州人民医院，云南大理 671000；2.大理学院药学院，云南大理 671000

云南雪胆（Hemsleya sinesis Cogn of Yunnan）为葫芦科（Cucurbitane）雪胆属（Hermleya）植物的干燥块根，具有清热、解毒、消肿止痛的功效，民间用来治疗肝炎、气管炎、胰腺炎、慢性子宫颈炎、带状疱疹、肿瘤等[1-5]。云南地不容（Stephania yunnanensis H.S.Lo）为防己科（Menisermaceae）千金藤属（Stephania）植物的干燥块根，具有清热、解毒、镇静、止痛、理气等功能，民间用于治疗风湿骨痛、胃痛、毒蛇咬伤等[6-7]。云南雪胆和云南地不容均为云南著名的传统中草药，民间使用较为广泛，二者均为干燥块根，从外形上看极其类似，很容易混淆，给人们的使用带来诸多不变。因此，建立一种快速检测方法，以区分两种药材是非常必要的。

超高效液相-质谱联用（UPLC-MS）作为一种新的检测技术，广泛用于各种分析检测领域，它可以同时获得液相色谱和质谱图，根据离子流信息计算出化合物的分子量，分析各种离子碎片可以确定化合物的结构式，从而在样品不纯时便能知道其主要成分，这对于天然产物的研究极为重要。本研究采用UPLC-MS对云南雪胆和云南地不容进行检测，从而建立一种鉴别两种药材的快速检测方法，为研究和使用两种药材提供一定依据。

1 材料与仪器

云南雪胆和云南地不容药材购自云南省药材公司（分别产自云南西双版纳和云南文山），经大理学院药学院周浓副教授鉴定为葫芦科雪胆属植物雪胆Hemsleya sinesis Cogn of Yunnan 和防己科千金藤属植物云南地不容Stephania yunnan ensis H.S.Lo的干燥块根；标准品左旋四氢巴马汀Tetrahydropalmatine 和雪胆甲素CucurbitacinⅡa购于中国科学院上海药物研究所国家重点实验室；实验试剂均为色谱纯，实验用水为纯净水。电子分析天平（Startorius CPA225D）；液相色谱/单极四级杆质谱仪（Waters，ACQUITY SQD LC/MS System）；C18反 相 柱（Waters，ACQUITY UPLC BEH C18，1.7 μm，2.1 mm×100 mm）。

2 方法与结果

2.1 供试品的制备

分别将云南雪胆和云南地不容块状根粉碎，各取5 g 置于250 mL 茄形瓶中，加入95%乙醇各125 mL，于80℃下水浴加热2 h，滤去残渣，分别将提取液减压蒸干至无醇味。分别将提取物用甲醇溶解置于10 mL 容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。溶液经0.45 μm 微孔滤膜过滤，即得供试品。

2.2 UPLC 条件

检测样品采用超高效液相色谱仪（Waters，ACQUITY UPLC H-class core system），配有超高效液相紫外检测器（Waters，ACQUITY UPLC TUV Detector）， 色谱柱采用 C18反相柱（Waters，ACQUITY UPLC BEH C18，1.7 μm，2.1 mm×100 mm），柱温 45℃。乙腈为色谱纯（Merck，gradient grade for liquid chromatography），水为纯净水。展开剂采用乙腈-水，从10%（V/V）到100%乙腈梯度洗脱，时间为6 min[8]。

2.3 UPLC-MS 检测

采用液质联用仪（ACQUITY SQD LC/MS System）进行检测，单四极杆质谱检测器，ESCI 离子源，电喷雾所用气体为氮气。

2.4 检测结果

云南雪胆和云南地不容经UPLC-MS 检测，结果见图1、2。图1A 中，所含主要成分保留时间为2.56 min，在负离子谱（图 2A）中观察到负离子峰如下：561.5（[M-H]-），607.5（[M+COOH]-），1169.8（[2M+COOH]-）。在正离子谱（图 2B）中观察到正离子峰如下：503.4（[M-AcO]+），1147.6（[2M+Na]+）。很容易确定其分子量为562.5，与文献报道雪胆中所含主要成分雪胆甲素的分子量一致，所以确定该药材为雪胆。图1B 中，所含主要成分保留时间为1.83 min，在正离子谱（图 2C）中观察到离子峰如下：356.3（[M+H]+），357.3（[M+2H]2+），确定其分子量为355.3，与文献报道云南地不容所含主要成分左旋四氢巴马汀的分子量一致，确定该药材为云南地不容（云南地不容没有负离子谱）。将供试品的保留时间、质谱图与标准品的保留时间、质谱图进行对照，保留时间一致，质谱图一致，证明该方法准确无误。

图1 云南雪胆和云南地不容UPLC

3 讨论

超高效液相色谱（ultra performance liquid chromatography，UPLC）系指一种采用小颗粒填料色谱柱（粒径小于2 μm）和超高压系统（压力大于105 kPa）的新型液相色谱技术，能显著改善色谱峰的分离度和检测灵敏度，同时大大缩短分析周期，因此特别适用于微量复杂混合物的分离和高通量研究。2004年3月，Waters公司率先推出了第一台商品化的超高效液相色谱系统（acquity，UPLC TM）。自问世以来，超高效液相色谱发展很快，现已成功应用于农药残留物检测、水质和环境监测、化妆品质量控制、药物及制剂的分析检测和质量控制、中药复杂组分分析及代谢组学等领域[9-10]。云南雪胆所含主要成分雪胆甲素的保留时间为2.56 min，通过负离子和正离子谱，可确认云南雪胆的分子量为562.5。云南地不容主要成分左旋四氢巴马汀的保留时间为1.83 min，通过正离子谱，可确认其分子量为355.3，与相关文献报道基本一致，从而可快速对上述两种外形较为相似的中药材进行快速鉴别。本实验采用UPLC-MS 检测云南雪胆和云南地不容，对其主要成分的质谱图进行分析，并对主要离子峰进行归属，确定分子量，从而鉴别两种药材。天然产物的品种繁多，许多药材外形极其类似，容易混淆，采用UPLC-MS 检测，可以在不分离纯化的前提下，快速确定其主要成分，从而鉴定药材，方法可靠，结果准确。

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