赵晓晓， 蔡 宇， 蔡天革

(1.暨南大学药学院，广东广州510632;2.辽宁大学生命科学学院，辽宁沈阳110036)

山芦桑颗粒剂由山药、芦根、桑椹、大枣等六味药材组成，具有增强免疫的作用，其主要有效部位为多糖。本实验采用超声提取方法提取该复方有效部位，为进一步制备成颗粒剂提供基础;通过单因素试验及正交试验［1-2］优选其提取工艺，采用苯酚-硫酸法［3］测定多糖量，以评价其提取工艺的合理性。

1 仪器与试剂

TU—1810S紫外-可见分光光度计 (北京普析通用仪器有限公司);SHZ—D(Ⅲ)循环水式真空泵 (巩义市英峪予华仪器厂);DZF—6050型真空干燥箱 (上海精宏设备有限公司);KQ—500E型超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司);DLSB—5/10型低温冷却液循环泵 (郑州长城科工贸有限公司);EYELA型旋转蒸发仪 (上海爱朗仪器有限公司);山药、芦根、桑椹、大枣等六味药材均购自广州二天堂药店;无水乙醇、丙酮等试剂均为分析纯，水为纯净水。

2 实验方法

2.1 多糖的提取工艺 按处方量称取药材，加入一定量的水，超声提取，合并提取液，离心 (3 600 r/min，15 min，4℃)，取上清液浓缩至相对密度0.8，加入适量95%乙醇使含醇量达到75%，冰箱静置过夜。过滤，沉淀分别用丙酮和无水乙醇交替洗涤，干燥，即得到粗多糖。

2.1.1 单因素试验 以该复方中多糖量为考察指标，分别考察超声功率、加水量、提取时间、提取温度对提取得到的多糖量的影响。

2.1.2 正交试验 根据单因素试验结果，确定正交试验因素水平，进行正交试验。

2.2 多糖的测定

2.2.1 对照品溶液的配制 精密称定已干燥的无水葡萄糖100 mg，置于100 mL量瓶中，加水溶解并定容至刻度。精密吸取5.0 m L于50 m L量瓶中，加水定容至刻度，即得0.1 mg/mL的对照品溶液。

2.2.2 5%苯酚溶液的配制 称取苯酚5 g于100 mL棕色量瓶中，加水充分溶解并定容至刻度，即得。

2.2.3 供试品溶液的配制 精密称定已干燥的粗多糖样品10 mg于100 mL量瓶中，加水溶解并定容至刻度，即得供试品溶液。

2.2.4 最大吸收波长的测定 精密吸取蒸馏水2.0 m L，加入5%苯酚溶液1.0 mL，迅速加入硫酸5.0 mL，摇匀，80℃水浴中加热15 min，取出，冷却，作为空白对照置于200～800 nm内调零。精密吸取对照品溶液和供试品溶液，加水补至2.0 mL，同上操作，在200～800 nm波长范围内扫描，供试品溶液和对照品溶液均在490 nm处有最大吸收，因此，最终确定最大吸收波长为490 nm。

2.2.5 线性关系的考察 精密吸取对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 m L共5份，分别置于10 mL量瓶中，加水补至2.0 mL，再加入5%苯酚溶液1.0 mL，摇匀，迅速加入硫酸5.0 mL，80℃加热15 min，取出，冷却至室温。另以2.0 mL蒸馏水同上平衡操作作为空白对照，490 nm波长处测定吸光度，得回归方程:A=0.046 4 C+0.033 9，R2=0.999 1(n=5)，线性范围2.5～12.5μg/mL。

2.2.6 精密度实验 精密吸取对照品溶液0.4mL于10mL量瓶中，加水补至2.0 mL，按照2.2.5项下操作，重复测定6次，490 nm处测得吸光度值。经计算，RSD为0.45%，表明仪器精密度良好。

2.2.7 样品中多糖的测定 精密吸取供试品溶液0.8 mL于10 mL量瓶中，按2.2.5项下操作，490 nm处测定吸光度，将测得的吸光度代入线性方程，求得质量浓度C，按以下公式计算多糖量:

其中，D为稀释倍数1 000，药材量为69 g。

3 结果

3.1 单因素试验结果

3.1.1 超声功率对多糖的影响 固定加水量12倍，提取温度50℃，提取时间20 min，提取次数1次，考察不同功率 (200W、300 W、400 W、500 W)对多糖量的影响。

如图1所示，随着超声功率的增加，提取得到的多糖量逐步增加。

图1 超声功率对多糖的影响

3.1.2 加水量对多糖的影响 固定超声功率300 W，提取温度50℃，提取时间20 min，提取次数1次，考察不同的加水量 (6倍，9倍，12倍，15倍，18倍)对多糖量的影响。如图2所示，随着加水量的增加，多糖量逐步增加，加水量为15倍时，多糖量最高，继续增加加水量，多糖量反而下降。

图2 加水量对多糖的影响

3.1.3 温度对多糖的影响 固定超声功率300 W，加水量12倍，提取时间20 min，提取次数1次，考察不同的温度 (40℃，50℃，60℃，70℃，80℃)对多糖量的影响。见图3所示，随着提取温度的增加，多糖量逐步增加。

图3 提取温度对多糖的影响

3.1.4 时间对多糖的影响 固定超声功率300 W，加水量12倍，提取温度50℃，提取次数1次，考察不同的提取时间 (10 min，20 min，30 min，40 min，50 min)对多糖量的影响。见图4所示，随着提取时间的增加，多糖量逐步增加，当提取时间为30 min时，多糖量最高，继续增加提取时间，多糖量下降。

图4 提取时间对多糖量的影响

3.2 正交试验结果 根据单因素试验结果，确定正交试验因素水平，选用L9(34)正交表进行正交试验。因素水平表见表1，正交试验结果见表2及表3。

表1 因素水平

表2 正交试验结果

表3 方差分析结果

由极差分析可知，因素的主次顺序为C＞B＞A，C(提取次数)为主要影响因素，因素A(加水量)的影响较小;由方差分析可知，因素C具有显著性差异。综合极差分析和方差分析结果可知，超声提取的最佳方案为A2B2C2，即15倍水提取2次，每次提取时间为30 min。

3.3 验证性实验 分别称取药材3份，按上述最佳方案进行提取，并测定多糖量，实验结果表明，由上述确定的最佳方案提取该复方多糖量较高，该方案较稳定。结果见表4。

表4 验证性实验结果

4 讨论

多糖是一类天然大分子化合物，具有多种生物活性，如抗肿瘤活性、抗菌活性、降血脂作用、调节免疫等［4-7］，因而受到国内外许多学者的关注。多糖类物质的提取方法较多，如热水浸提法，酶提取法，超声提取方法，微波辅助提取方法等［8-11］。其中，超声提取方法是近年来常用于提取中草药有效成分的新方法，其原理是利用超声波的机械作用、热学作用、空化作用等对植物细胞的破碎作用，加速植物有效成分的溶出、扩散，具有省时、节能、操作简便、避免高温对有效成分的破坏等优点［12］。

山芦桑颗粒剂是一种以多糖为主要有效部位的复方制剂，本实验采用苯酚-硫酸法测定多糖量，通过单因素试验及正交试验优选其超声提取工艺。其中，单因素试验以多糖量为考察指标，分别考察了超声功率、加水量、提取时间、提取温度对多糖提取效果的影响，考虑到成本和时间，提取次数一般不超过3次，因此未对提取次数进行单因素考察。根据单因素试验结果，选用加水量、提取时间、提取次数为正交试验因素水平，超声功率为500 W，提取温度为80℃，进行正交试验。对正交试验结果进行极差分析可知，因素主次顺序为C＞B＞A，即提取次数＞提取时间＞加水量，提取次数对多糖量的影响最大，加水量的影响最小。由方差分析结果可知，因素C即提取次数具有显著性差异，其余因素均无显著性差异。为了节约浓缩时的成本，选择A2，因此最佳提取方案为15倍水超声提取2次，每次提取时间为30 min。

本实验研究确定了该复方制剂超声提取的提取方法和相关条件，为其制备成颗粒剂提供了基础;但采用超声提取方法超声提取方法破碎了植物的细胞，加速了多糖的溶出、扩散，故本提取方法提取出的杂质也相应增加，其中提取出的多糖经过醇沉后仍含有少量单糖等杂质，还有待进一步纯化。参考文献:

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［4］Zhang M，Cui SW，Cheung PCK，etal．Antitumor polysaccharides from mushrooms:a review on their isolation process，structural characterisics and antitumor activity［J］．Trends in Food Science＆ Technology，2007，18(1):4-19．

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［10］叶余原．超声法提取铁皮石斛多糖工艺的研究［J］．中药材，2009，32(4):617-620．

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