高丽娟， 杨 乔， 王 峥， 胡耀红

(1.天津医科大学研究生院，天津300070;2.天津医科大学总医院中医科，天津300052)

动脉粥样硬化 (atherosclerosis)是一种慢性炎 症反应性疾病［1］，尽管动脉粥样硬化发生的因素是多方面的，但最终都导致动脉内膜损伤，而粥样硬化病变的形成是动脉对内膜损伤做出的炎症纤维增生性反应的结果［2］。高脂血症是动脉粥样硬化发生、发展的主要危险因素之一。在长期高脂状态下，增高的脂蛋白尤其是氧化低密度脂蛋白 (oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)具有高度细胞毒性，易造成血管内皮细胞损伤［3］。目前研究发现，损伤的内皮细胞可诱导性表达多种黏附分子，如黏附分子-1(ICAM-1)等，黏附分子可介导白细胞与内皮细胞黏附，促进循环中白细胞迁移并聚集于动脉内膜［4-5］，参与动脉的炎症过程，是动脉粥样硬化形成的重要因素［6］。

脉血康胶囊为水蛭经适宜的加工制成的胶囊剂。水蛭为水蛭科动物蚂蝗Whitmania pigra Whitman、水蛭 Hirudo nipponica Whitman或柳叶蚂蝗Whitmania acranulata Whitman的干燥全体，具有破血逐瘀通经的功效。目前有关水蛭素的研究已有很多，天然水蛭素是从水蛭中提取的一种抗凝血蛋白质，具有抗凝、抗血栓等作用，是迄今为止世界上最强的凝血酶抑制剂，在治疗各种血栓性疾病及弥散性血管内凝血中均有很好的预防及治疗效果，由于它安全且没有副作用，因而比肝素更有优越性。1986年，随水蛭素的cDNA被克隆出来之后，重组水蛭素的研究取得了很大的进步。传统中药是干燥的水蛭全体入药，对水蛭干燥全体的基础研究甚少，对其作用机制更是未知。临床观察显示脉血康胶囊对心脑血管疾病［7-8］、外周血管疾病有较好疗效。本实验通过观察脉血康对高脂血症大鼠脂质代谢、一氧化氮 (NO)水平及主动脉内皮细胞ICAM-1表达的影响，以探讨脉血康预防动脉粥样硬化形成的可能性及其作用机制。

1 实验材料

1.1 动物 健康雄性SD大鼠50只，平均体质量(180±20)g，购于中国医学科学院放射研究所实验动物中心，许可证号:SCXK(津)2010-0002。

1.2 药物及主要试剂 脉血康胶囊为水蛭经适宜的加工制成的胶囊剂，本实验所用药物为脉血康胶囊内容物即水蛭粉 (批号:20110715)，由贵州信邦制药股份有限公司提供;高脂饲料 (配方:82.7%普通饲料、2%胆固醇、0.3%胆盐、5%蔗糖、10%猪油)和普通饲料由天津实验动物中心饲料厂提供;血脂检测试剂盒购自中生北控生物科技股份有限公司;血糖试剂盒购自保定长城临床试剂有限公司;纤维蛋白原试剂盒购自天津美德太平洋科技有限公司;一氧化氮试剂盒购自南京建成生物工程研究所;大鼠细胞ICAM-1酶联免疫检测试剂盒购自美国R＆D公司。

1.3 主要仪器 D—320型全自动生化分析仪 (南京英诺华医疗科技公司)，TS—6000型半自动血凝仪 (天津美德太平洋科技有限公司)，TU—1810紫外可见分光光度计 (北京普析通用仪器有限责任公司)等。

2 实验方法

2.1 分组及处理 适应喂养1周，将大鼠分为5组，即正常对照组，模型组，脉血康胶囊高、中、低 (3.0、1.5、0.3 g/kg)剂量组，每组各10只。除正常对照组外，其余各组均喂高脂饲料，次日按10 mL/kg开始灌胃给药，正常对照组和模型组灌服等容积生理盐水，每天1次，连续8周，并于每周称体质量一次以调整给药量。

2.2 观察指标及方法

2.2.1 血清指标 分别于第4周和实验末，各组动物禁食 (自由饮水)12 h，次日清晨取血3 mL，3 000 r/min离心15 min，取上层血清，于全自动生化仪上测血糖、血清总胆固醇 (TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇 (LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇 (HDL-C)水平，并根据公式AI=(TC－HDL-C)/HDL-C，计算AI。实验末，同时取血清，用硝酸还原酶法测血清NO的水平，具体步骤均按试剂盒说明书进行。

2.2.2 血浆指标 实验末，取血2 mL，3.2%枸橼酸三钠与全血按1∶9比例迅速混匀，离心取上层血浆，按试剂盒说明于半自动血凝仪上测血浆纤维蛋白原 (FIB)水平。

2.2.3 组织指标 颈椎脱臼处死动物后，剖开胸、腹腔，取胸主动脉，剥离外膜脂肪组织后于－80℃冰箱保存。取标本待复温后，用预冷生理盐水漂洗，去除血迹，滤纸拭干，称质量，将血管浸入冷生理盐水(生理盐水质量为血管的9倍)，剪碎，在冰水浴中制成10%的组织匀浆，离心取上清液，按试剂盒说明用ELISA法检测主动脉ICAM-1的表达。

2.3 统计学方法 采用SPSS 16.0统计软件处理，计量资料以均数±标准差 (± s)表示，多组资料组间比较采用单因素方差分析:方差齐者用 LSD检验，方差不齐者用Tamhane's T2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 脉血康对高脂血症大鼠体质量的影响 实验初，各组大鼠体质量无差异，每周各组大鼠体质量均增加，自实验第2周起，模型组大鼠体质量明显高于正常对照组 (P＜0.05)，各治疗组大鼠体质量低于模型组，但差异无统计学意义，见表1。

表1 大鼠体质量的动态变化 ( ± s，n=10)Tab.1 Dynam ic changes of body weight in rats( ± s，n=10)

表1 大鼠体质量的动态变化 ( ± s，n=10)Tab.1 Dynam ic changes of body weight in rats( ± s，n=10)

注:与正常对照组比较，☆P＜0.05。

组 别 剂量/(g·kg－1)体质量/g 0周 2周 4周 6周 8周正常对照组 － 177.9±13.9 261.8±24.5 320.8±33.6 368.2±38.6 369.1±42.4模型组 － 185.9±17.0 285.5±32.0☆ 357.4±45.7☆ 410.0±51.1☆ 436.7±62.1☆脉血康组 0.3 180.0±14.0 271.4±14.1 325.0±20.8 387.5±22.9 396.6±25.0脉血康组 1.5 179.4±22.6 278.8±22.2 347.0±35.3 404.8±44.5 420.1±51.8脉血康组 3.0 180.0±16.2 279.3±18.2 345.3±29.4 373.2±30.6 420.0±41.0

3.2 脉血康对高脂血症大鼠血糖的影响 第4周时，各组大鼠血糖无差异。第8周时，模型组大鼠血糖明显高于正常对照组 (P＜0.01)，各治疗组大鼠血糖明显低于模型组 (P＜0.01)，提示脉血康有降糖作用，见表2。

表2 大鼠血糖的动态变化( ± s，n=10)Tab.2 Dynam ic changes of b lood glucose in rats( ± s，n=10)

表2 大鼠血糖的动态变化( ± s，n=10)Tab.2 Dynam ic changes of b lood glucose in rats( ± s，n=10)

注:与正常对照组比较，☆☆P＜0.01;与模型组比较，※※P＜0.01。

组 别 剂量/(g·kg－1)血糖/(mmol·L －1)4周 8周正常对照组 － 3.78±0.30 4.08±0.52模型组 － 3.65±0.48 6.01±0.99☆☆脉血康组 0.3 4.57±1.15 4.53±0.49※※脉血康组 1.5 3.31±0.74 4.38±0.68※※脉血康组 3.0 4.39±0.98 4.75±0.81※※

3.3 脉血康对高脂血症大鼠血脂的影响 第4周时，模型组大鼠血清TC、LDL-C水平较正常对照组明显升高，HDL-C水平明显降低 (P＜0.01)，提示高脂血症造模成功;各治疗组大鼠血清TC、LDL-C水平较模型组有降低趋势，HDL-C有升高趋势;各组大鼠血清TG水平无显著差异。第8周时，模型组大鼠血清TG、TC、LDL-C水平均较正常对照组明显升高，HDL-C水平明显降低 (P＜0.05或 P＜0.01);各治疗组大鼠血清TG、TC、LDL-C水平较模型组明显降低，HDL-C水平明显升高 (P＜0.05或P＜0.01)，提示脉血康有调脂作用，见表3。

3.4 脉血康对大鼠动脉粥样硬化指数 (AI)的影响 模型组大鼠AI较正常对照组明显升高 (P＜0.05)，各治疗组大鼠 AI较模型组有降低趋势，但差异无统计学意义，见表4。

表3 大鼠血脂的动态变化( ± s，n=10)Tab.3 Dynam ic changes of blood lipids in rats( ± s，n=10)

表3 大鼠血脂的动态变化( ± s，n=10)Tab.3 Dynam ic changes of blood lipids in rats( ± s，n=10)

注:与正常对照组比较，☆P＜0.05，☆☆P＜0.01;与模型组比较，※P＜0.05，※※P＜0.01。

组 别 时点 剂量/(g·kg－1) TC/(mmol·L－1) TG/(mmol·L－1)LDL-C/(mmol·L－1)HDL-C/(mmol·L－1)正常对照组 4周 －1.54±0.16 1.31±0.11 0.46±0.05 1.32±0.25 8周 － 1.65±0.25 1.27±0.24 0.57±0.08 1.18±0.25模型组 4周 － 3.05±0.94☆☆ 1.23±0.90 0.94±0.34☆☆ 0.96±0.25☆☆8周 － 3.34±0.04☆☆ 1.74±0.08☆ 1.20±0.29☆☆ 0.83±0.10☆☆脉血康组 4周 0.3 2.67±0.85 0.91±0.21 0.80±0.23 1.17±0.23 8周 0.3 2.63±0.96 1.30±0.32 0.91±0.36 0.91±0.22脉血康组 4周 1.5 2.62±0.59 0.96±0.25 0.82±0.20 1.19±0.20 8周 1.5 2.72±0.19 1.23±0.36※ 0.95±0.26 1.03±0.19※脉血康组 4周 3.0 2.60±0.72 1.02±0.22 0.78±0.25 1.20±0.18 8周 3.0 2.58±0.47※※ 1.53±0.30 0.94±0.18※※0.96±0.10

表4 大鼠动脉粥样硬化指数的变化 ( ± s，n=10)Tab.4 Changes of AI in rats( ± s，n=10)

表4 大鼠动脉粥样硬化指数的变化 ( ± s，n=10)Tab.4 Changes of AI in rats( ± s，n=10)

注:与正常对照组比较，☆P＜0.05。

组 别 剂量/(g·kg－1)AI正常对照组 －1.00±0.10模型组 － 1.84±0.34☆脉血康组 0.3 1.78±0.36脉血康组 1.5 1.61±0.33脉血康组3.0 1.69±0.27

3.5 脉血康对高脂血症大鼠血清NO和血浆FIB的影响 模型组大鼠血清NO水平较正常对照组明显降低 (P＜0.05)，各治疗组大鼠血清NO水平较模型组明显升高 (P＜0.05)。模型组大鼠血浆FIB水平较正常对照组有升高趋势，各治疗组大鼠血浆FIB水平较模型组有下降趋势，但差异均无统计学意义，见表5。

3.6 脉血康对大鼠主动脉细胞间ICAM-1表达的影响 模型组大鼠ICAM-1的表达较正常对照组明显增强 (P＜0.05)，各治疗组大鼠ICAM-1的表达较模型组明显减弱 (P＜0.05)，见表6。

表5 大鼠血清NO和血浆FIB的变化( ± s，n=10)Tab.5 Changes of NO and FIB in rats( ± s，n=10)

表5 大鼠血清NO和血浆FIB的变化( ± s，n=10)Tab.5 Changes of NO and FIB in rats( ± s，n=10)

注:与正常对照组比较，☆P＜0.05;与模型组比较，※P＜0.05。

分组 剂量/(g·kg－1)NO/(μmol·L－1)FIB/(mmol·L －1)正常对照组 － 54.75±26.09 2.74±0.28模型组 － 26.53±13.46☆ 3.25±0.82脉血康组 0.3 54.04±30.17※ 2.82±0.58脉血康组 1.5 58.00±25.75※ 2.84±0.15脉血康组 3.0 56.36±22.70※2.86±0.70

表6 大鼠主动脉中ICAM-1蛋白水平的变化( ± s，n=10)Tab.6 Changes of ICAM-1 protein contents in aortic wall in rats( ± s，n=10)

表6 大鼠主动脉中ICAM-1蛋白水平的变化( ± s，n=10)Tab.6 Changes of ICAM-1 protein contents in aortic wall in rats( ± s，n=10)

注:与正常对照组比较，☆P＜0.05;与模型组比较，※P＜0.05。

分组 剂量/(g·kg－1) ICAM-1/(ng·mL－1)正常对照组 －3.98±1.29模型组 － 5.58±0.48☆脉血康组 0.3 4.19±1.10※脉血康组 1.5 4.33±1.21※脉血康组 3.0 4.40±1.30※

4 讨论

高脂血症是动脉粥样硬化发生和发展的主要危险因素之一。研究表明，血脂异常，尤其是TC、LDL-C升高与血管内皮功能紊乱独立相关［9］。本研究采用高脂饲料造模后，大鼠血清 TC、TG、LDL-C升高，而HDL-C降低，呈现典型的脂质代谢紊乱状态，说明大鼠高脂血症模型建立成功。实验结果表明脉血康可明显降低血清TC、TG、LDLC水平，升高HDL-C水平，并降低动脉粥样硬化指数 (AI)。提示脉血康胶囊可以纠正高脂状态下脂质代谢紊乱，并通过调节脂质代谢，抑制动脉粥样硬化斑块的形成。

NO是重要的病理生理因子，一氧化氮合酶(NOS)是NO合成过程的关键酶。NOS分为内皮型 (eNOS)、神经型 (nNOS)、诱生型 (iNOS)，前两种又称为结构型一氧化氮合酶 (cNOS)，主要存在于内皮细胞和神经细胞，cNOS活性只能维持几秒到几分钟，由它催化生成的NO量较少，但具有广泛的生理功能，如抑制血小板聚集、中性粒细胞黏附，调节微血管张力等，对机体具有保护作用［10］。iNOS主要存在于炎性细胞、血管平滑肌细胞、成纤维细胞等细胞中，在正常情况下不表达，当细胞受到炎性细胞因子或免疫微生物刺激时，iNOS将催化合成非生理浓度的大量NO，超过生理浓度的NO可与超氧阴离子(O－2)反应生成过氧化亚硝基阴离子 (ONOO－)，后者是强氧化剂，可造成脂质过氧化和内皮损伤，促进动脉粥样硬化的发生发展。NO在心血管疾病中起保护作用还是有害作用与NOS的类型、NO产生的量及机体的氧化应激状态有关［11］。有研究报道水蛭乙醇提取物具有降低NO水平的作用［12］，但在本实验中，脉血康可升高NO水平。当内皮细胞受损时，内皮原来的eNOS活性降低，NO产生减少，此时水蛭粉升高NO水平，提示水蛭可通过保护血管内皮细胞功能升高NO水平，抑制动脉粥样硬化的形成;当炎性细胞、血管平滑肌细胞、成纤维细胞等细胞受到炎性细胞因子或免疫微生物刺激时，iNOS表达及活性增加，诱导产生大量NO时，水蛭又可以通过抑制炎症反应降低NO水平，抑制动脉粥样硬化的形成。可见在不同的病理环境中，水蛭可通过纠正NO代谢紊乱，抑制动脉粥样硬化的形成。

ICAM-1是存在于细胞表面的一种糖蛋白，其中以血管内皮细胞表面表达最强，正常情况下ICAM-1表达微弱甚至不表达，在动脉粥样硬化初始形成过程中，血管内皮受损后，ICAM-1表达增加，高脂血症时，血脂升高促进超氧阴离子产生，使低密度脂蛋白发生氧化修饰。研究表明，ox-LDL可以上调内皮细胞ICAM-1的表达，诱导单核细胞向血管内皮浸润，单核细胞吞噬ox-LDL变为激活的巨噬细胞，最终成为充满脂质的泡沫细胞［13］。本研究中，模型组ICAM-1的表达较正常对照组增强，脉血康治疗组ICAM-1的表达较模型组减弱，提示脉血康可通过抑制ICAM-1的表达发挥抗动脉粥样硬化的作用。

综上所述，高脂状态下血脂异常、血管内皮损伤是动脉粥样硬化形成的重要环节，脉血康胶囊通过调节脂质代谢、纠正NO代谢紊乱、保护血管内皮功能及抑制ICAM-1的表达，干预动脉粥样硬化的形成。此外，脉血康胶囊有明显的降糖作用和一定的降纤维蛋白原作用。对于其调脂机制、降纤维蛋白原作用是否与促纤溶作用有关及降糖机制等问题，尚待进一步研究。

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