陈美群 冯广达 邓名荣 朱红惠

近年来，由于病原微生物耐药性的日益增强和新型感染性疾病的不断涌现，寻求和开发新的微生物资源，对新型抗生素的发现和耐药性感染性疾病的治疗具有重大的现实意义［1］。随着陆源微生物资源的日趋枯竭，海洋将成为微生物资源的主要来源［2］。高盐、高压、低营养的独特海洋环境，使海洋微生物形成了不同于陆源微生物的代谢途径，产生大量的化学结构新颖、抑菌效果较好、或有特殊作用的生物活性物质［3，4］。已知微生物来源的生物活性物质中，放线菌来源的生物活性物质约占70％，其中以链霉菌属（Streptomyces）为主，约占50％［5］。海洋放线菌是新药开发和天然活性产物的重要来源，有关海洋放线菌来源的新型生物活性物质的报道正逐渐增多［6，7］，据 Lam［8］不完全统计在 2003-2005年短短3年内就从海洋放线菌中分离到23个具有较好开发潜力的新型药源活性物质，具有良好的抗菌、抗肿瘤等活性。本研究从分离自南海沉积物的71株放线菌中筛选到一株产高活性抗菌物质的放线菌MQ-86，针对该菌株进行形态学、生理生化和分子生物学鉴定，以阐明其分类地位。同时，对该菌株的最佳抑菌活性培养基以及其活性代谢产物对多株耐药菌的抑制效果进行初步的研究，旨在为下一步从该菌株中分离新型活性代谢产物奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 71株放线菌菌株由广东省微生物菌种保藏中心从南海沉积物样品中分离并保藏。

1.1.2 受试菌株 3株普通菌：大肠杆菌（Escherichia coli）8739、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）6538、白色念珠菌（Candida albicans）10231由广东省微生物菌种保藏中心提供；5株耐药菌：大肠杆菌（Escherichia coli）480（耐11种抗生素）、大肠杆菌（Escherichia coli）460（耐11种抗生素）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）206（耐13种抗生素）、沙门氏菌（Salmonella sp.）47（耐9种抗生素）、沙门氏菌（Salmonella sp.）31（耐9种抗生素）由华南农业大学蒋红霞教授惠赠。

1.1.3 培养基［9，10］①高氏一号培养基：可溶性淀粉 20g，KNO31g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O0.5g，NaCl0.5g，FeSO4·7H2O0.01g，蒸馏水1000mL，pH7.2；②氯化钙（CL）培养基：CaCl245g，酵母提取物40g，葡萄糖5g，蒸馏水1000mL，pH7.8；③GBP培养基：葡萄糖10g，牛肉膏3g，蛋白胨5g，蒸馏水1000mL，pH7.2；④培养基：大麦提取物（Malt extract）10g，葡萄糖4g，酵母提取物4g，蒸馏水1000mL，pH7.8；⑤营养肉汤培养基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，蒸馏水1000mL，pH7.2-7.6；⑥PGY培养基：蛋白胨10g，酵母膏5g，葡萄糖1g，蒸馏水1000mL，pH6.8-7.0。

1.2 方法

1.2.1 抗菌活性菌株的初筛 将71株海洋放线菌接种于100mL高氏一号培养基中28℃振荡培养7d，发酵液在8000r/min条件下离心20min，上清液用8层纱布过滤，滤液用等体积乙酸乙酯萃取后旋转蒸发得代谢产物粗提物，用甲醇将代谢产物溶解定容至1mL，得代谢产物粗提液。抑菌活性的筛选采用琼脂平板打孔法［11］，以大肠杆菌（Escherichia coli）8739、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）6538、白色念珠菌（Candida albicans）10231为指示菌。在每个培养皿内打孔4个，其中3个孔注入发酵代谢产物粗提液30μL，另一个孔注入液体培养基30μL作为空白对照，每个处理重复3次，待培养后观察记录抑菌圈结果。

1.2.2 菌株MQ-86最佳抑菌活性培养基的筛选 将放线菌MQ-86接种于高氏一号培养基、GBP培养基、氯化钙（CL）培养基和培养基中，参考“1.2.1方法”进行最佳抑菌活性培养基的筛选。

1.2.3 菌株MQ-86的抑菌活性研究 将菌株MQ-86接种到最佳发酵培养基（培养基）中，按“1.2.1方法”得到代谢产物的粗提物，进行其抑菌活性的分析。以3株普通菌：大肠杆菌（Escherichia coli）8739、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）6538、白色念珠菌（Candida albicans）10231和5株耐药菌：大肠杆菌（Escherichia coli）480、大肠杆菌（Escherichia coli）460、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）206、沙门氏菌（Salmonella sp.）47、沙门氏菌（Salmonella sp.）31为受试菌。将受试菌原液用梯度稀释法稀释，用血球计数板计数，制得不同浓度的受试菌菌悬液。在营养肉汤琼脂平板上加100μL不同浓度的受试细菌菌悬液，涂布均匀，在PGY琼脂平板上加100μL不同浓度的白色念珠菌（Candida albicans）10231菌悬液，涂布均匀。待干后用打孔器（直径5mm）在每个培养皿内打孔4个，其中2个孔注入MQ-86菌株的代谢产物粗提液30μL，一个孔以氨苄青霉素100μg/mL作阳性对照，另一个孔以甲醇做阴性对照，每个处理重复3次。细菌于37℃培养24h，白色念珠菌于28℃培养48h，观察记录抑菌结果并测量其抑菌圈直径。

1.2.4 菌种鉴定 形态学和生理生化鉴定：参考《伯杰细菌鉴定手册》［12］和《链霉菌鉴定手册》［13］。

分子生物学鉴定：对获得的纯培养物菌株使用BIOMIGA基因组抽提试剂盒提取总DNA，然后用于目的基因的扩增。放线菌16S rDNA部分序列的扩增采用通用引物27F/1492R［14］。扩增程序如下：94℃5min；94℃ 45s，55℃ 45s，72℃ 1min，30 个 循环；72℃ 10min。16S rDNA扩增产物经检测、纯化后，送交测序公司测序，利用NCBI数据库进行序列比对分析，获取相近典型菌株的16S rDNA序列，然后用CLUSTAL X软件进行全序列比对，利用MEGA3.0中的邻接法（Neighbor-Joining）［15］建立16S rDNA序列的系统发育树。

2 结果

2.1 抗菌活性海洋放线菌的初筛

在71株海洋放线菌的高氏一号发酵粗提物中没有1株放线菌对大肠杆菌有抑制作用；有4株对白色念珠菌有抑制作用，占总菌数的5.63％；有20株对金黄色葡萄球菌有抑制作用，占总菌数的28.17％（表1），其中菌株MQ-86对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径大于20mm，抗菌效果最好。

表1 71株海洋放线菌的抑菌活性初筛

2.2 海洋放线菌MQ-86 最佳抑菌活性培养基的筛选

不同培养基发酵产物粗提物的抑菌活性如表2所示。M2+培养基的发酵产物粗提物具有较强的抑菌活性，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌都有很好的抑菌活性，尤其对白色念珠菌的抑菌效果最强，抑菌圈直径达到了29.33mm。而CL培养基的发酵产物粗提物却完全失去了抑菌活性，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌都没有抑菌活性。高氏一号、GBP培养基的发酵产物粗提物都能对金黄色葡萄球菌产生抑菌活性，而对大肠杆菌、白色念珠菌都没有任何抑制效果，其原因可能是不同的发酵培养基组分改变了菌株MQ-86的代谢产物种类或产量。由此可见，海洋放线菌MQ-86的最佳抑菌活性培养基为培养基。

表2 菌株MQ-86不同培养基发酵粗提物的抑菌活性

2.3 菌株MQ-86 最佳发酵培养基粗提物抑菌活性分析结果

2.4 菌株MQ-86鉴定结果

菌株MQ-86在高氏一号培养基生长旺盛，28℃培养7d菌落直径达3.0-4.0mm；菌落呈圆形、表面凹凸不平、边缘白色、中间浅灰色、可溶色素呈粉红色；基内菌丝和气生菌丝均很丰富，基内菌丝无横隔、不断裂；气生菌丝柔曲、多分枝；孢子丝直形、中长（图2）。该菌株能够分解纤维素，水解淀粉，还原硝酸盐，明胶液化缓慢，牛奶不凝固，不产生黑色素、酪氨酸酶和硫化氢，能利用阿拉伯糖、木糖、果糖、葡萄糖、蔗糖和鼠李糖，不能利用棉籽糖、甘露醇和肌醇。对菌株MQ-86的16S rDNA扩增测序，从GenBank中得到相关菌株的16S rDNA序列并构建系统发育树（图3）。结果表明，该菌株与小链霉菌NR043833.1处于同一分支、序列同源性高达99.89％。结合其形态学和生理生化特征，初步鉴定为小链霉菌（Streptomyces parvus）MQ-86。

表3 菌株MQ-86的培养基发酵粗提物对供试菌株的抑制效果

表3 菌株MQ-86的培养基发酵粗提物对供试菌株的抑制效果

-：表示无抑菌活性

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图 1 菌株MQ-86的+培养基发酵粗提物对部分受试菌的抑制效果

图2 菌株MQ-86的形态特征

3 讨论

目前，抗生素类药物在临床上得到广泛的使用，使由微生物引起的感染性疾病得到有效的控制，但同时也导致许多致病菌对抗生素类药物产生了严重的耐药性，特别是耐药性的肠杆菌和葡萄球菌的蔓延，极大地危害着人类的健康［16］。万古霉素被公认为是目前最有效的抗生素，但耐万古霉素的金黄色葡萄球菌也已出现［17］。2010年在南亚发现的新型超级病菌NDM-1［18］，它对除替加环素和黏菌素以外的所有已知抗生素都具有耐药性。耐药菌株的逐渐增多及其耐药性的不断增强限制了现有抗生素的临床治疗效果，寻找和开发新型抗生素资源势在必行。放线菌代谢具有多样性，能够产生的生物活性物质极其丰富，是新型抗生素的主要来源。海洋放线菌研究起步较晚，目前从海洋分离到的放线菌有18个属，约占放线菌总属数的10％，可见未知的海洋放线菌资源数量巨大，从海洋放线菌中发现新型抗菌活性物质的机率较高［19］。

图3 菌株MQ-86的16S rDNA 序列系统进化树

本研究从71株海洋放线菌中筛选到一株产高活性抗菌物质的放线菌MQ-86，对其进行了初步鉴定和抗耐药菌活性的研究。初步鉴定MQ-86为小链霉菌，链霉菌是产抗菌素类物质的重要资源菌种，国内外研究表明链霉菌产生的抗菌素类物质具有较好的抑菌效果和无毒副作用等优点［20，21］，具有重要的商业和医用价值，但目前对小链霉菌（Streptomyces parvus）的研究资料仍相对匮乏。除孙建龙等［22］从大连海域分离的小链霉菌PH33对番茄溃疡病菌具有较强的抑制活性、康银花等［23］报道的小链霉菌NIM521能对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）有强烈抑制活性和田兆丰等［24］分离的小链霉菌Yn168能够拮抗3种植物病毒外，未发现有关小链霉菌抑制病害菌及耐药菌的报道。本研究分离的菌株（Streptomycete parvus）MQ-86的发酵产物粗提物对共耐18种常用抗生素的耐药性大肠杆菌480/460（耐环丙沙星、左氧氟沙星、氨苄西林、头孢他啶、头孢噻肟、头孢西丁、四环素、氯霉素、卡那霉素、庆大霉素、链霉素）和耐药性金黄色葡萄球菌206（耐环丙沙星、氨苄西林、头孢他啶、头孢噻肟、四环素、氯霉素、头孢曲松、青霉素、苯唑西林、红霉素、替卡西林、磺胺甲恶唑、阿米卡星）都有明显的抑制作用，表明菌株MQ-86具有可观的研究前景和药用潜力。目前我们正在对该菌株的代谢产物进行分离纯化，并进行其结构的鉴定和活性测试，以期为新型药物的开发提供研究基础。

4 结论

采用平板打孔抑菌法筛选对多重耐药菌的抑制作用；通过菌株形态学特征、生理生化特征和16S rDNA序列对菌株进行分类鉴定。结果显示，筛选到一株对多株多重耐药菌均有较强抑制作用的海洋放线菌MQ-86，菌株MQ-86的M2+培养基粗提物对普通的大肠杆菌（Escherichia coli）8739、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）6538、白色念珠菌（Candida albicans）10231和共耐18种主要抗生素的多重耐药性大肠杆菌（Escherichia coli）480、大肠杆菌（Escherichia coli）460、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）206都有较好的抑制效果。菌株MQ-86对多株多重耐药菌均具有较强的抑制活性，经初步鉴定为小链霉菌（Streptomyces parvus）。

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