肖红梅 肖旭 刘志红 李金泉

DBY（DDX3Y，DEAD box on the Y）基因是精子发生中起关键性作用的基因之一，在动物繁殖育种中起着重要作用［1，2］。它位于哺乳动物Y染色体的AZFa区［3，4］，是AZFa区最主要的候选基因。编码一个ATP依赖性RNA解螺旋酶，属于DEAD（天冬氨酸-谷氨酸-丙氨酸-天冬氨酸序列）盒蛋白家族的成员，参与细胞的各种过程，包括剪接，核糖体合成和RNA降解等［5］。人的DBY基因位于USP9Y基因下游45 kb处，含有17个外显子，其编码的mRNA在睾丸组织中特异表达，主要见于精子和粗线期的精母细胞中，DBY的缺失可导致生精细胞的严重减少甚至完全缺乏，显示的病理性表型为生精细胞生长障碍，而且在AZFa区中DBY的缺失率比 USP9Y 高［6-8］。Kleiman等［9］通过无精症患者组织检查发现：精子发生障碍时，DBY基因转录物表达不足。因此，DBY基因微缺失在AZFa区缺失类型中极具代表性。Foresta等［8］在对精子生成障碍患者进行睾丸活检时发现，DBY缺失的患者表现为I型唯支持细胞综合征和小睾丸症，即仅有支持细胞而无精原细胞。同时在对小鼠体的同源基因DBY研究也同样发现，DBY的缺失导致小鼠精子发生障碍［10，11］，证明了DBY对睾丸精子发生的重要作用。

但迄今为止，DBY基因在生殖细胞发育中的具体作用还不清楚。为此，国内外的一些专家对哺乳动物DBY基因进行了研究，但由于Y染色体结构复杂，存在大量的重复序列，难于组装，所以研究的物种很少，大量集中于对人的研究，而对绒山羊的研究尚未见报道。因此，本试验对绒山羊Y染色体DBY基因进行了筛选与测序，旨在为进一步研究DBY基因在绒山羊Y染色体上的定位、分析其在精子发生中的作用机理以及基因进化提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

绒山羊BAC文库由内蒙古农业大学动物遗传育种实验室提供，血液采集于鄂尔多斯羊场随机选取的10头绒山羊（5公，5母）的颈静脉血。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的制备 选100-120μL抗凝血加双蒸水至1.5mL，充分混匀，冰浴10min后12000r/min离心1min，弃上清，向下层沉淀中加100μL

双蒸水使之充分悬浮，煮沸10min，立即冰浴5min，以12000r/min离心5min，取上清于另一个离心管即可用于PCR检测，于-20℃保存备用。

1.2.2 引物设计 以GenBank收录的牛的DBY序列为模板，应用软件Primer设计引物并由上海生物工程有限公司合成。上游引物序列：5'-tcatctgttggaacttttc-3'；下游引物序列：5'-atctccttggttttagcc-3'。

1.2.3 PCR扩增条件 以建库的内蒙古绒山羊基因组为模板，通过正交拉丁设计方法确定DBY基因最佳的20μL PCR反应体系为：上下游引物（10 pmol/μL）各为0.5μL，绒山羊基因组DNA模板（30ng/μL）1.1μL，10×buffer 2μL，dNTP 2.1μL，Taq DNA 聚合酶 0.3μL，超纯水13.5μL。PCR 反应循环程序：94℃预变性5min；94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸 45s，32个循环；72℃延伸 5min，4℃保存。PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.4 超级池的筛选 根据已确定的扩增条件，以绒山羊基因组BAC文库的超级池DNA为模板，加一个阳性对照（以已扩增出的基因组为模板）、一个阴性对照（以灭菌超纯水为模板）和一个绒山羊的雌性基因组对照，进行PCR反应，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，筛出DBY基因所在的二级池编号。

1.2.5 二级池筛选 以超级池筛选出的阳性二级池DNA为模板，通过PCR反应（反应条件同筛选阳性超级池的条件）筛选DBY基因所在的板池、行池、列池，并加阴阳性对照。PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，获得二级池的板池、行池、列池的阳性克隆编号。

1.2.6 阳性克隆、测序 依照二级池的PCR筛选结果，确定DBY基因阳性克隆在BAC文库中的位置，从-80℃冰箱中取出冻存的菌样，挑取文库中的目的菌落，在含有氯霉素（12.5μg/mL）的 LB平板上划线，37℃恒温培养，得到包含DBY基因的阳性单克隆并鉴定。然后把PCR产物纯化、回收，连接到T载体上，并将连接产物转化到大肠杆菌中，通过蓝白斑筛选，将阳性克隆进行划线培养并进行菌体PCR阳性检测。对检测得到的阳性克隆菌液培养过夜，将菌液送交上海生工进行测序。

1.2.7 系统进化树的构建 利用Mega5软件，根据与山羊同源物种的DBY基因序列建立物种间的NJ系统树（Neighbour-joining tree），进行进化分析。

2 结果

2.1 超级池筛选

以稀释10倍的超级池DNA为模板54℃扩增，扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶进行检测，在凝胶成像系统下观察PCR 扩增情况，结果如图1所示。从凝胶电泳图可以看出，通过PCR 扩增得到阳性二级池有两个，分别为S21（泳道5）和S24（泳道8），经过多次检验，最终确定S21为所需条带。其条带单一而且明亮并与雌性对照条带大小不同。扩增的片段大小为240bp左右。

2.2 二级池筛选

将阳性二级池S21稀释10倍后，取4μL做PCR模板，扩增二级池。PCR反应条件同超级池。扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶进行检测，结果如图2所示。

图1 DBY超级池筛选

图2 DBY二级池筛选

根据S21池行、列、板池的定位结果，得到DBY基因在基因组BAC文库中的位置为行池D、4列池3、6列池6、板池5，定位于405D22。

2.3 菌体PCR鉴定

从文库中找到405D22的阳性克隆，在1mL的LB培养基（加有氯霉素12.5μg/mL）中，37℃恒温培养24h，之后做菌体PCR鉴定。为得到更好的克隆结果排除假阳性，菌落PCR时，做了3个平行的菌落，结果（图3）显示，所得到的菌体PCR产物条带很清晰，且与目的条带大小一致，可鉴定出获得的单克隆为阳性。然后选取条带最清晰的菌，进行后续的胶回收工作。

图3 DBY菌体PCR鉴定

2.4 PCR产物回收、菌体重组质粒鉴定

将菌体PCR产物（图4）切胶回收、纯化后，用紫外-可见分光光度计检测DNA纯度，OD值（A260/A280）为1.87，胶回收效果较好，可用于亚克隆鉴定。

图4 胶回收电泳检测

2.5 克隆鉴定

将回收的菌体PCR产物用pEASY-T1载体连接，转化后，37℃培养过夜，挑取单克隆划线，做菌体PCR鉴定阳性克隆，结果如图5所示，菌体PCR产物条带与目的基因条带一致，清晰可见，说明转化成功，可用于亚克隆测序。

图5 DBY克隆鉴定

2.6 DBY克隆测序

经序列测序，得到引物扩增基因组产物片段长度为240bp，序列碱基组成如图6所示。该序列中A+T和G+C含量分别为70％和30％，A+T的含量相对较高。与GenBank收录的其他物种序列进行比对：与绵羊DBY基因的同源性为96％；与坡鹿、水牛的同源性达93％；与猪鹿、瘤牛和牛的同源性分别达92％和91％；而与人和黑猩猩及小鼠的序列无同源性。此片段长为240bp，包括长为186bp的内含子和54bp的外显子，共编码52个氨基酸。筛选出的BAC为Y染色体基因组片段。

图6 DBY碱基序列

2.7 进化分析

从构建的NJ系统进化树（图7）可看出，首先山羊和绵羊、野牛和瘤牛的亲缘关系最近，分别属于哺乳动物偶蹄目、牛科羊亚科和牛亚科；其次是泰国坡鹿和缅甸坡鹿的亲缘关系较近，属于偶蹄目的鹿科、鹿亚科；最后，它们与属于猪科的猪鹿、牛科的水牛聚为一类，亲缘关系相对较远。

图7 哺乳动物偶蹄目DBY基因NJ系统进化树

3 讨论

本实验室构建的绒山羊细菌人工染色体BAC文库保存在720个384孔板中，每个超级池由20个384孔板组成。以超级池为单位提取文库DNA，分别得到超级池DNA 36个，二级池DNA 1 656个，每一个超级池含有二级池DNA 46个，其中板池20个，行池16个，4列池4个，6列池6个，共有288个行池、180个列池、360个板池，含有27×104个克隆［12］，因此精确的定位对于获得正确的阳性克隆至关重要。本研究在BAC文库的定位PCR筛选过程中，由于文库具有11.8倍的覆盖率，所以首先必须保证合适浓度的筛库工作液，其次要有优化的扩增体系和扩增条件，因此需要对扩增的体系和条件进行大量的摸索工作，得到最优化体系。但由于在设计引物时，没有山羊的模板序列，选用GenBank收录的牛DBY基因序列设计引物，引物的特异性不强，在进行PCR扩增时，体系难以建立，所以在筛库中，基因难以定位。为了加快筛库速度，提高效率，采用正交拉丁方优化体系，并经过验证，方法可行。通过优化的扩增体系和条件所得的阳性克隆经测序为目的克隆。而且此研究获得的Y染色体DBY基因片段填补了山羊该基因序列空白。通过序列比对，DBY基因在牛科动物中具有一定的保守性，而与其他物种的保守性很差，尤其与人和黑猩猩及小鼠的序列无同源性，而人和小鼠之间DBY却有较高的相似性［6］。NJ系统进化树得出山羊、绵羊、水牛等物种间在NJ系统进化树中所反映的亲缘关系同其在分类学中的位置基本一致［13］。Foresta等［6］在对人类Y染色体AZFa区基因进行研究时发现DBY有17个外显子，编码一个ATP依赖的RNA解旋酶，属于DEAD BOX（Asp-Glu-Ala-Asp）家族。但本研究所得的片段中编码序列无天冬氨酸编码，与其有差异。这可能是由于克隆片段的编码序列太短，基因序列不完整造成的，也可能是由于山羊和人及小鼠的同源性差，编码序列不同的缘故。因此，山羊的DBY基因的结构、进化及功能还有待进一步研究。后续将对获得的405D22 BAC测序，并对测序序列进行生物信息学分析。并以此BAC末端序列为模板设计引物，进行绒山羊Y染色体其他BAC的筛选，获得山羊Y染色体功能区序列，逐步构建Y染色体序列的contig。

4 结论

首次获得山羊Y染色体DBY基因片段240bp，共编码52个氨基酸；其与绵羊、牛的同源性较高，而与人、黑猩猩及小鼠无同源性；经鉴定筛选出的405D22基因组BAC为山羊Y染色体BAC。

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