张云婷 于定群 程怡 汤浩茹 王清明 张勇

在植物的花色成分中，类黄酮、甜菜素和类胡萝卜素是三类最主要的色素［1，2］，且大多数植物花色素属于类黄酮［3］。 查尔酮合成酶（chalcone synthase，CHS）是类黄酮类物质合成的关键酶，在苯丙氨酸合成途径中，香豆酰辅酶A 和丙二酰辅酶A 在查尔酮合成酶催化下产生苯基苯乙烯酮［4，5］。此中间物的异构化和功能基团的进一步取代都能导致黄酮、异黄酮和花色素苷的合成。这些化合物为自然界提供了颜色，并参与了植物的多种生理过程，包括防紫外线辐射、抗病、生长素运输、花粉的育性等［6，7］。查尔酮合成酶的表达受 UV 照射［8］、真菌侵染等条件诱导［9］，且在花中特异性表达［10］，其表达量的改变可能导致植物花色的变异［11］。CHS在植物中是普遍存在的，现认为最早在陆生植物中出现。例如，轮藻纲和苔藓植物［6，12-15］。 到目前为止在GenBank注册的与CHS有关的核酸序列已经有5000多条，涉及到的植物主要是豆科的大豆、苜蓿、豌豆；十字花科的拟南芥；禾本科的水稻、玉米；葡萄科的葡萄等，其中观赏植物主要有矮牵牛、莲、水仙、菊花、蝴蝶兰和金鱼草等［16］。

CHS转基因的研究开展得比较广泛。1986年，Coen 等［17］对金鱼草的花色突变体研究表明，突变体花色变淡或变浅蓝色，并推测该现象由CHS基因所控制。1990年 van der Krol等［18］将 CHS基因反义片段导入矮牵牛，结果花朵色素合成受阻，花冠颜色变浅，但花药正常。1993年Elomaa等［19］利用农杆菌介导法将 CHS 基因反义片段导入非洲菊（Gerberahybrida）中，内源CHS合成受到抑制，花色合成大大受阻，从而使花色发生改变。1994年Gutterson 等［20］利用正义和反义手段，将来自菊花（Chrysanthemummorifolium）的一个CHS基因导入开粉红色花的菊花中，结果分别获得了开浅红色和白色花的转基因植株。2000年Suzuki等［21］将CHS基因转入蓝色夏中，花瓣部分花色由蓝色变为白色。2005年Koseki等［22］在mRNA水平上分析了矮牵牛Red Star 6个花色苷生物合成过程中的重要基因发现，只有CHS基因的表达受到抑制才使花冠形成红白相间的现象；2006年祝钦拢［23］将彩叶草CHS基因转入烟草中，烟草叶片出现了色斑。从以上结果可以看出，CHS在植物花色呈现过程中的重要作用。

长期以来月季的品种改良一直依赖于传统的遗传育种方法，关于通过调控CHS基因的表达量来改变月季的花色报道较少。基因工程技术在观赏植物花色育种上可弥补传统育种技术的缺陷，可在保持原有性状的基础上，改变观赏植物的花色，甚至创造该物种所不具有的花色，在较短时期内培育出稳定遗传的新品种、新类型，孕育着巨大的经济效益。另一方面它也是研究基因表达、调控和互作机理的热点课题。鉴于此，本试验希望通过克隆得到月季CHS基因序列及其表达分析，为进一步花色基因工程作准备。对月季进行品种改良，使其花色更加多样化，在园林上具有更好的观赏价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 ‘仙境’月季（Rosahybrid）由四川农业大学园艺学院提供，在晴朗的上午10点左右采集月季初开期（S1）、盛开期（S2）、衰败期（S3）中层花瓣后，进行液氮速冻，置于-80℃保存备用。

1.1.2 试剂 3％ CTAB，PVP，75％乙醇，氯仿，异丙醇，DEPC处理水，反转录试剂盒（Fermentas），琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（生工生物上海有限公司），Easy-GoTMRT PreMix（北京赛百盛基因技术有限公司），pMD19-T vector（宝生物工程大连有限公司），大肠杆菌感受态细胞JM109（宝生物工程大连有限公司），LB平板培养基以及其他常用试剂。

1.1.3 仪器 超低温冰箱（Thermo，美国）、超纯水系统（F4PN84631，MILLIPORE）、全自动高压灭菌锅（TOMY，日本）、PCR（Polymerase Chain Reaction）仪（Bio-Rad，美国）、低温高速离心机（Eppendorf，德国）、超净工作台（SW-CJ-2FD 型，苏州安泰）、凝胶成像系统（SYNGENE，美国）、恒温摇床（HQL150C 型，武汉中科）、恒温箱、电泳仪（北京六一仪器厂）、电泳槽、电热恒温干燥箱（上海跃进医疗器械厂）、微波炉等。

1.2 方法

1.2.1 总RNA的提取和cDNA第一条链的合成 花瓣总RNA的提取采用改良后的CTAB法［24］，在RNA提取过程中防止RNA污染，减少降解。按照反转录酶使用方法进行合成 cDNA 第一条链，20μL PCR 反应体系，此过程在冰上进行。

1.2.2 查尔酮合成酶基因cDNA片段的克隆与测序 根据GenBank上已登录的 CHS 同源基因的蛋白质保守序列，利用CODEHOP软件设计了一对简并引物，引物由上海生物工程有限公司合成。

引物：RhCHSF：5'-CCKTCHYTGGAYGCNMGRCARGAC-3'；RhCHSR：5'-GGBCCRAANCCRAANARMACACC-3'。对月季花瓣总RNA经反转录后合成的第一条链cDNA进行扩增。扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性1min，47℃退火1min，72℃延伸1min，34个循环；72℃延伸10min；12℃保存。扩增产物电泳检测后用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的条带，将回收产物与克隆载体pGEM-T easy连接，转化大肠杆菌JM109，用蓝白斑筛选重组子，筛选出阳性克隆及 PCR 检测，选取经鉴定含有目的片段的菌液送至测序。测序由上海英骏生物公司完成。

1.2.3 表达分析 采用半定量RT-PCR的方法，把月季在初花期（S1）、盛花期（S2）、衰败期（S3）所提取的总RNA进行反转录后，合成单链cDNA。利用甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参，调整PCR 反应模板量。根据RhCHS序列，设计一对特异引物RhCHS forward 和reverse，引物RhCHSF：5'-CGACTACTACTTCCGTAT-3'；RhCHSR：5'-TTCAACAACCACCATATC-3'。扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性1min，47℃退火1min，72℃延伸1min，36个循环；15℃保存。

2 结果

2.1 总RNA的质量检测

从月季花瓣中提取的总RNA近无色，不呈胶状，经琼脂糖凝胶电泳检测，紫外凝胶成像仪观察发现，在 RNA 条带附近及点样孔周围没有发亮现象，初步鉴定样品基本不含多酚、蛋白质等杂质；同时，如图1所示，28S，18S和5S 条带条带清晰干净，条带之间不弥散。其中28S RNA条带的亮度为18S RNA条带的2倍，说明提取得到的总 RNA 完整性好。紫外分光光度计测定，A260/A280=1.91，A260/A230=1.79表明提取的总 RNA 样品较纯净，样品中多酚及蛋白质的含量等杂质很少，无 DNA污染。以上说明改良后的CTAB法适合月季花瓣 RNA的提取，且提取的总RNA 质量较高，可用于后续试验。

图1 提取的月季花瓣总RNA电泳图

2.2 CHS基因cDNA保守区序列的PCR扩增

以逆转录合成的cDNA 第一链为模板，利用一对简并引物RhCHSF和RhCHSR进行保守区扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳，可见一条约850bp 的条带（图2）。对该片段进行回收、连接转化、测序，得到一段860bp的cDNA 序列与预期片段长度一致。通过 Blast程序，与GenBank 上的其他植物的比较分析，该片段序列与已登录月季品种（Kardinal：AB038246.1；Xing-xing-hei：HQ423171.1）、草莓（Fragaria×ananassa：AB201758.1）、树莓（Rubus idaeus：AF400567.1）、 悬 钩 子（Rubushybrid：JN602374.1）、碧桃（Prunus persica：JN391444.1）等植物的同源性达到 98％、92％、92％、87％和87％，推测该序列为CHS基因cDNA 的同源片段（表3）。

图2 月季 CHS基因保守区序列扩增电泳图

表3 月季与其他蔷薇科植物CHS基因同源性比较

2.3 不同时期月季查尔酮合成酶基因（CHS）的表达

采用RT-PCR的方法对CHS在月季花发育过程中的表达变化进行分析，通过凝胶电泳（图3）可以看出，衰败期的CHS表达量几乎没有，而盛花期的表达量最高，CHS从初花到衰败呈现出先上升后下降的趋势，与其花瓣颜色变化相一致，这是由于CHS影响花色素的积累。

3 讨论

进行分子生物学试验提取高质量的RNA是最首要和关键一步，在提取RNA的过程中通常会受到污染物的干扰。植物组织中富含的糖、酚类、蛋白质、植物次生代谢物质，DNA等限制了高质量RNA的分离［25，26］。目前，大多采用 CTAB 法提取 RNA［27-29］。本试验用的材料是花瓣，色素等次生代谢物质较多，分离纯净的RNA难度较大，所以采取了改良后的CTAB法，通过凝胶电泳和分光光度法对提取的RNA进行检测，3条带清晰完整，RNA的A260/A280在 1.8-2.0范围内，质量较好，符合后续试验的要求，且该方法简单易行，耗时短。

将克隆得到的核苷酸基因序列翻译成氨基酸序列，提交NCBI在线用BLAST 进行搜索比对，RcCHS与其他植物有较高的同源性，说明CHS在进化过程中的保守性。PCR扩增遵循酶促反应定律，开始的循环内扩增产物呈指数累积，产物和模板呈线性关系；当达到平台效应时，随着循环次数的增加，产物产率不再增加。半定量RT-PCR正是利用产物和模板的这一线性关系，通过扩增来对比目的基因的表达。结果显示，月季花瓣初开到衰败，查尔酮合成酶基因表达的规律，先上升后下降，在盛花期达到峰值，衰败期几乎无表达，可能因为植物后期代谢减缓，物质分解消耗等原因。CHS基因是一个较大的基因家族，研究表明，在大部分植物当中CHS存在多拷贝，在同源基因之间的表达呈现差异特性。例如，拟南芥中CHS基因在花、叶、果中都有表达［30］，而矮牵牛中的CHSA和CHSJ只在花粉囊和花冠中特异表达［31］。在一些植物中CHS在不同的发育时期表达的位置也不相同。在一些植物的早期发育阶段，CHS出现在叶片组织中［32］，而成熟植株中主要限于花组织中表达［33］。CHS基因在同一器官中的表达部位也不尽相同。2006年，Mahroug等［34］通过原位杂交技术，表明长春花CHS基因在花瓣的上表皮表达。而有些植物的CHS基因则在花药中表达。2010年，宋婷婷等［35］在苹果属观赏海棠 McCHS 基因的克隆及实时定量研究中推测CHS的相对表达量在整个叶片的发育过程中会逐渐发生改变或者发生不同部位、器官的特异表达。大量研究表明，CHS基因表达模式受到外界环境因子、上游启动子序列和转录因子共同调控。

本研究克隆到了月季花瓣查尔酮合成酶基因的片段，为以后获得CHS全长奠定了基础，同时探索了月季不同发育时期CHS的表达情况，为其着色机理和分子育种提供了理论基础。

4 结论

从月季（Rosahybrida）花瓣中成功提取出总RNA，获得RhCHS的cDNA片段长度为860bp，编码287个氨基酸残基，GenBank登录号KC145553。同源序列比对发现，月季RhCHS与其他植物的同源性很高，说明CHS 在进化的过程中具有高度的保守性。表达谱分析表明，CHS在盛花期表达量最高。

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