陈宇杰 陈明 乌兰巴特尔 郝金凤 高峰 哈斯阿古拉

乙烯作为一种重要的植物激素，在植物生长发育、成熟衰老等诸多生理过程中起着极为重要的作用［1］。乙烯受体是乙烯信号转导途径中的一个关键因子，研究表明乙烯受体的存在是乙烯应答顺利进行所必需的［2］。编码乙烯受体的基因属于多基因家族，在拟南芥乙烯受体基因家族中已发现5个成员ETR1、ERS1、ETR2、ERS2和EIN4［3］，根据其结构特征，将乙烯受体家族成员分成两个亚家族，亚家族Ⅰ包括ETR1和ERS1，亚家族Ⅱ包括ETR2、ERS2和EIN4。目前，人们已经从番茄［4］、梨［5］等多种果实中克隆到了乙烯受体基因ETR1。1999年，Sato-Nara等［6］从甜瓜品种FuyuA和Natsu4中克隆到Cm-ETR1cDNA序列，基因表达分析结果表明，Cm-ETR1在完全膨大期果实果皮有少量表达，在成熟早期和后期的果皮中的表达逐渐增强。但目前尚不了解该基因在甜瓜果实成熟及呼吸跃变过程中的确切功能。

本研究以典型的呼吸跃变型甜瓜品种河套蜜瓜为研究对象，从成熟果实中克隆Cm-ETR1cDNA全长序列，分析果实不同发育时期内源乙烯生成规律，并应用定量PCR技术分析该基因在甜瓜果实发育成熟过程中的表达特性，为阐明Cm-ETR1 基因在甜瓜果实成熟及呼吸跃变过程中的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

甜瓜品种河套蜜瓜（Cucumismelo L.cv Hetao）原种，由本实验室保存。选取大田种植的9个成熟果实，取中果皮组织于液氮速冻，用于基因克隆。从授粉后0d开始，每隔5d采摘果实，直至果实完全成熟变软，取中果皮组织于液氮速冻，用于基因表达分析。为保证数据的准确性和可靠性，每天上午9时采摘果实，重复3次。

大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α由本实验室保存。反转录试剂盒为Invitrogen公司产品；克隆载体pMD19-T、限制性内切酶、PrimeSTARTMHS DNA聚合酶、dNTPs、氨苄青霉素、 DNAmarker以及SYBR® Premix Ex TaqTM定量PCR试剂盒等为大连宝生物公司产品；PCR产物纯化试剂盒为上海生工生物工程有限公司产品；其余试剂为进口或国产分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取 采用乙酸钾-氯化锂方法［7］提取甜瓜果实总RNA。由于甜瓜果皮富含多糖，多糖能够与核酸形成复合物并共沉淀下来，影响下一步的反转录PCR扩增，本试验利用乙酸钾将水相中的多糖选择性的沉淀出来，达到了除去多糖的目的。

1.2.2 引物设计与合成 根据GenBank中登录的甜瓜乙烯受体基因Cm-ETR1cDNA序列（登录号：AF054806），设计合成RT-PCR引物，上游引物P1序列为：5'-CTACTCTAGATTGCCATGGAGAACTGTT-3'，下游引物P2序列为：5'-TGACGGATCCGATATCTCTCTGTCTACT-3'。根据所克隆的Cm-ETR1基因cDNA序列，设计合成该基因的定量PCR检测引物，上游引物P3为：5'-GCAACTGCCCTTATGCTTGT-3'，下游引物P4为：5' -CTTGAGTACGAATGAGTCCC-3'，扩增片段大小为121bp。以甜瓜甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）基因（登录号：AB033600）为定量PCR检测内参基因，上游引物GP1为：5'-ATCATTCCTAGCAGCACTGG-3'，下游引物GP2为：5'-TTGGCATCAAATATGCTTGACCTG-3'，扩增片段大小为278bp。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.3 PCR扩增和克隆 取5μg河套蜜瓜总RNA做模板，加50μmol/L Oligo（dT）20引物1μL，加10mmol/L dNTP 2μL，灭菌无RNase水5μL，65℃变性5min，迅速放在冰上5min；然后依次加入5×cDNA合成缓冲液4μL、0.1mol/L dTT 1μL、15U/μL反转录酶M -MLV 1μL、40U/μL RNase-out 1μL。反应条件：50℃，50min；60℃，10min；70℃，10min；85℃，5min；4℃，5min。反应结束后，加2U/μL RNase H 1μL，37℃保温30min，-20℃保存备用。

以合成的cDNA第一链为模板，建立常规的PCR反应体系，采用PrimeSTARTMHS DNA聚合酶扩增Cm-ETR1基因全长cDNA 。PCR 反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性50s，50℃退火40s，68℃延伸2min；35个循环，68℃延伸10min。PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳。

PCR产物经纯化后与经SmaⅠ酶切的pUC19载体连接，转化大肠杆菌DH5α，在含有Amp（100mg/L）的LB平板上筛选阳性克隆，经 XbaⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定，分别从3个独立PCR产物的重组克隆中各选取1个克隆，进行序列分析。将所得序列结果与已报道的cantalupenis甜瓜ETR1基因cDNA进行BLAST序列相似性分析，用 DNAMAN6.0软件进行序列比较分析。

1.2.4 在GenBank中进行Cm-ETR1蛋白BLAST比对，搜索到一批相似性很高的蛋白，从中选出9个相似性最高的ETR蛋白，利用DNAMAN6.0软件对这些蛋白序列进行相似性比对分析，采用MEGA4.02软件的邻接法（Neighbor-Joining，NJ）构建系统进化树，并进行1000次Bootstrap检验。

1.2.5 果实内源乙烯含量的测定 从授粉后第15至30d每隔5d，以及第30d后每隔1d，采摘甜瓜果实，并立即从果实内腔中采集气体样品，水封法保存于小玻璃瓶内，用气相色谱仪测定乙烯含量，为保证数据的准确性和可靠性，采样在每天上午9时进行，重复3次。

1.2.6 定量PCR分析基因表达特性 用SYBR®Premix Ex TaqTM定量PCR试剂盒进行定量PCR检测。反应体系为：反转录产物1μL，SYBR Premix Ex Taq（2×）12.5μL，上游引物（5μmol/L）1μL，下游引物（5μmol/L）1μL，加无菌超纯水至总体积为25μL，混匀。用Opticon 3Real-time PCR System（Bio-Rad公司）进行分析，PCR扩增条件为：95℃预变性10s；95℃变性5s，60℃退火延伸20s，共进行40个循环。数据采用2-ΔΔCT方法进行分析，授粉后0d的甜瓜果实基因表达量设定为1，标准误差（SEs）来自3个重复样本。

2 结果

2.1 Cm-ETR1cDNA的 RT-PCR扩增

以反转录产物为模板，PCR扩增后得到约2.2 kb的特异性条带（图1），与预期大小相符。

2.2 Cm-ETR1cDNA的克隆及序列分析

将PCR扩增得到的特异性条带进行克隆，对重组克隆进行双酶切鉴定（图2）。为避免由于PCR扩增和序列分析造成的误差，对3个独立PCR扩增产物的重组克隆进行测序，并对其进行对比分析，获得了Cm-ETR1cDNA序列（图3）。结果表明，克隆的cDNA核苷酸序列长度为2256bp，编码区长度为2223bp，编码740个氨基酸组成的蛋白，其核苷酸序列（登录号为EF495185）和推断的氨基酸序列与已报道cantalupenis甜瓜的相应序列完全相同。

图1 PCR扩增产物

图2 重组质粒的酶切鉴定

2.3 Cm-ETR1与其他植物乙烯受体蛋白的相似性及系统进化树分析

对Cm-ETR1与9个相似性最高的其他植物乙烯受体蛋白进行了序列比对分析。结果表明，Cm-ETR1与黄瓜乙烯受体蛋白的相似性最高（为99％），与龙眼乙烯受体蛋白的相似性最低（为86％）。系统进化树分析表明（图4），这10个乙烯受体蛋白首先聚类形成两个分支，其中一个小分支由同属的甜瓜和黄瓜乙烯受体蛋白组成，而大的分支则由龙眼、草莓、李、巴旦木、西洋梨、沙梨、苹果和枇杷的乙烯受体蛋白组成。进行Bootstrap检验发现，除巴旦木及李的分支与西洋梨等的分支的Bootstrap值较低外，其他分支的Bootstrap值均大于90，说明应用MEGA4.02软件的NJ 法构建的系统进化树较为可靠。

图4 甜瓜Cm-ETR1蛋白的系统进化树分析

2.4 甜瓜果实内源乙烯含量测定

Excel软件分析在甜瓜果实不同发育阶段内源乙烯含量变化。结果（图5）显示，在授粉后第40-41d出现了一个呼吸高峰，表现在乙烯含量的急剧增加。而乙烯峰值出现前后的发育阶段乙烯释放量较少，且变化幅度较小。河套蜜瓜果实这种乙烯合成方式符合典型的呼吸跃变型果实的内源乙烯合成规律。

图5 甜瓜果实内源乙烯含量

2.5 甜瓜果实不同发育成熟阶段Cm-ETR1基因的表达特性分析

定量PCR结果（图6）显示，在果实发育初期，Cm-ETR1基因转录水平较低且变化较小，在授粉后第35d，即果实内源乙烯生成高峰前期，表达量显著增加。在授粉后第40d，Cm-ETR1基因的表达水平达到最高值，约为授粉后第0d的5倍。随后，Cm-ETR1基因表达水平显著下降。

图6 甜瓜果实发育成熟过程中Cm-ETR1基因的表达

3 讨论

研究表明，乙烯受体基因家族的各成员在蛋白结构和基因时空表达上各有其特点［8］。对拟南芥的研究表明，随着乙烯合成能力的增强，ETR1的mRNA水平下降［9］。在番茄中ETR1是组成型表达的，其mRNA水平不受乙烯合成的影响［10］。在乙烯信号转导过程中，乙烯受体各成员在功能上存在冗余性，但各成员对乙烯信号转导的调控能力不同。拟南芥ETR1功能丧失突变体ert1-7对乙烯更加敏感而且乙烯反应更强烈，表明在乙烯信号转导过程中ETR1比其他乙烯受体发挥着更重要的作用［11］。拟南芥ETR1和ERS1基因双突变体etr1-9；ers1-3的研究表明，与亚家族Ⅱ的3个成员相比，亚家族Ⅰ的ETR1和ERS1两个成员在乙烯信号转导过程中具有更强烈的调控作用［12］。本研究从甜瓜品种河套蜜瓜成熟果实中克隆了乙烯受体亚家族Ⅰ成员ETR1基因Cm-ETR1的全长cDNA，对Cm-ETR1基因在甜瓜果实发育成熟过程中的表达特性进行了分析，Cm-ETR1基因的表达在授粉后第40d达到最高值，与乙烯峰几乎同时出现，表明Cm-ETR1基因可能在乙烯诱导的甜瓜果实成熟及呼吸跃变过程中发挥重要作用。

4 结论

从典型的呼吸跃变型甜瓜品种河套蜜瓜中克隆了乙烯受体基因Cm-ETR1cDNA，其核苷酸序列及推断的氨基酸序列与cantalupenis甜瓜的相应序列完全一致。在该甜瓜果实发育和成熟过程中，内源乙烯合成和Cm-ETR1基因的表达均呈单峰曲线，前者的峰值出现在授粉后第40-41d，而后者的峰值出现在授粉后第40d。Cm-ETR1基因的表达与果实发育成熟进程及乙烯合成呈显著正相关。

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