黎 涛，白崇峰，马春山，于晋建，王 云

MAGE（melanoma antigen）基因是首先由 Boon等[1]从恶性黑素瘤中分离、鉴定出的一族肿瘤特异性抗原基因，其中MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3基因是最早被发现的三个成员。MAGE-1基因第3外显子编码的一段多肽抗原经MHC-Ⅰ类分子HLAA1呈递后，能够被自体杀伤性T淋巴细胞（CTL）识别，诱导CTL杀伤肿瘤细胞的活性。本研究采用逆转录-聚合酶链式反应 （RT-PCR）和DNA印迹（Southern blot）的方法，对MAGE基因家族的3个成员 MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3 mRNA 在 56 例非小细胞肺癌（NSCLC）组织中的表达情况进行观察，探讨以该基因家族成员作为靶点对NSCLC患者进行免疫治疗的可能性。

1 资料和方法

1．1 细胞系与标本 以人髓性甲状腺癌细胞系TT作为阳性对照[1]，以小鼠成纤维细胞系3T3TK作为阴性对照。TT细胞和人肺腺癌细胞系SPC-A-1购自上海中科院细胞库，3T3TK、人肺癌细胞系A549、A431均由上海长征医院全军临床免疫中心细胞免疫室提供，上述细胞系均贴壁生长于含10%小牛血清的RPMI 1640完全培养基中。56例NSCLC和相邻正常肺组织标本取自上海长征医院胸外科手术患者。其中男35例，女21例；年龄33～75岁，平均64.4岁；术后病理证实为鳞状细胞癌29例，腺癌25例，大细胞癌2例。病变组织被切除后5~10 min进行取材，剪取肿瘤组织和相邻正常肺组织并立即冻存于液氮中，以保证mRNA不被降解。

1．2 总RNA抽提 培养细胞 （5~10）×106个加入1 ml Trizol裂解液（Gibco BRL公司），覆盖整个单层细胞；将标本组织剪碎放入匀浆器中，50 mg加入1 ml Trizol，彻底匀浆。将上述培养细胞和标本组织的裂解物移入1.5 ml Eppendorf管中，室温放置5 min，加入 200 μl氯仿，振荡混匀，室温静置 5 min；1.3×104r/min，4℃离心15 min，将上层水相转移到干净的1.5 ml Eppendorf管中，加入等体积的异丙醇，混匀后室温放置 10 min；1.3×104r/min，4 ℃离心10 min，弃上清，加入 1 ml 75%乙醇溶液，1.3×104r/min，4℃离心10 min，弃上清，将沉淀置于室温干燥10 min，用DEPC处理水溶解，分光光度计定量。

1．3 逆转录合成cDNA第1链及PCR反应 按AMV逆转录酶（Promega公司）说明书配制逆转录反应体系，取 2 μg总 RNA，加入 3 μl AMV 逆转录酶，配成终体积为25 μl的反应体系，将该体系置于42℃孵育60 min，94℃ 5 min灭活酶，贮存于-20℃待扩增。MAGE-1基因第3外显子扩增引物序列[1]：上游 5’-AGT CCT CAG GGA GCC TCC-3’，下游：5’-ACT CAG CTC CTC CCA GAT TT-3’。 内对照β-actin的扩增引物序列为：上游：5-ATC ATG TTT GAG ACC TTC AAC ACC CCA GCC-3，下游：5-AAG AGA GCC TCG GGG CAT CGG AAC CGC TCA-3。PCR反应体系的配制和反应条件见参考文献[1]。每份标本均以β-actin为内对照，除引物不同外其余条件相同。PCR反应在PE9600型（USA）扩增仪中进行，扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳分析，数码相机拍照。

1.4 PCR扩增产物的转膜及探针杂交 将细胞系TT、3T3TK、SPC-A-1、A549、A431 和 33 例 MAGE基因表达阳性的琼脂糖凝胶回收，通过毛细管转移法将扩增产物转至尼龙膜上。MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3基因特异性寡核苷酸探针序列分别为[1]：MAGE-1：5’-GGC AAC CCA GTG AGG GTT C-3’；MAGE-2：5’-GAC AAT CCG ATG AGG GCT C-3’；MAGE-3：5’ -GCC AAT CCT ATG AGG ACT C-3’。按地高辛标记试剂盒说明将上述寡核苷酸探针进行标记，在适宜条件下用地高辛标记的寡核苷酸探针与扩增产物进行分子杂交[2]，最后加入适量酶底物液显色并拍照。

1：电泳 Marker；2：TT；3：SPC-A-1；4：3T3TK；5：A549；6：A431 7、9、11：肿瘤标本①、②、③；8、10、12：正常肺标本①、②、③图 1 RT-PCR扩增编码MZ2-E抗原的基因片段

1：TT；2：3T3TK；3：SPC-A-1；4：A549；5：A431；6～38：33 例肿瘤标本图 2 RT-PCR扩增产物Southern Blot分析结果

图 3MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3 mRNA在NSCLC中的表达形式

2.1 MAGE基因在NSCLC组织中的表达 RTPCR目的基因长度为489bp，内对照β-actin长度为422 bp。3种人肺癌细胞系均表达该产物；56例NSCLC患者肿瘤组织中，33例表达该产物，表达率为58.9%，正常肺组织均不表达该产物。检测样品的内对照β-actin均有表达（图1）。

2.2MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3 mRNA 在NSCLC组织中的表达 3种人肺癌细胞系中，MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3 mRNA的表达情况如下：SPCA-1：MAGE-1+、-2+、-3+，A549：MAGE-1+、-2-、-3+，

2 结果

A431：MAGE-1+、-2+、-3+。56 例 NSCLC 标本中，MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3 mRNA 的表达例数分别是 27、18、30，表达率分别为 48.2%、32.1%、53.6%（图2）。33例MAGE基因表达阳性的NSCLC标本中，MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3 mRNA 的表达形式为：MAGE-1+、-2+、-3+：12 例；MAGE-1+、-2-、-3+：12 例；MAGE-1-、-2+、-3+：4 例；MAGE-1+、-2+、-3-：2 例；MAGE-1-、-2-、-3+：2 例；MAGE-1+、-2-、-3-：1例；没有一例标本单独表达MAGE-2 mRNA。见图3。

3 讨论

MAGE基因家族的编码蛋白是肿瘤特异性抗原的典型代表。人类MAGE基因家族定位于X染色体上[3]，其家族成员之间的同源性达80%～99%。MAGE基因正常情况下仅在睾丸和胎盘组织中有少量表达，但在多种不同组织来源的恶性肿瘤组织中，该家族基因成员如 MAGE-1、-2、-3、-4、-6 及-12却常被激活而有不同程度的表达，这可能与肿瘤组织中甲基化调节过程的失控有关[4]。近期的研究表明，NSCLC组织中，由MAGE基因启动子去甲基化介导的MAGE基因表达与NSCLC的侵袭性密切相关[5]。

本研究采用RT-PCR的技术，用MAGE-1基因第3外显子的扩增引物进行PCR扩增，MAGE-2和MAGE-3基因在这段序列上与MAGE-1基因具有高度同源性，若有扩增产物出现，则表明这三个基因成员中至少有一种mRNA在检测对象中有表达，以此了解MAGE基因在NSCLC组织中的表达率。

本文资料显示MAGE基因家族三个成员在NSCLC中的表达率为58.9%，表明以MAGE基因家族成员作为NSCLC免疫治疗的攻击靶点能够覆盖超过半数的患者，并有较好的特异性。3种人肺癌细胞系均表达MAGE基因，这为进一步的实验奠定了基础。实验中所检测的56例正常肺组织均不表达MAGE基因，说明该基因在NSCLC组织中具有肿瘤组织特异性，有望成为一类新的肿瘤标志物而在NSCLC的早期诊断、微转移灶检测和复发的检测等工作中发挥作用。

本研究还应用Southern blot的方法，对MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3mRNA 在 NSCLC 组织中各自的表达情况进行了研究。结果显示，MAGE-1、MAGE-3mRNA 在3种人肺癌细胞系中均有表达，MAGE-2 mRNA在2种人肺癌细胞系中有表达，这为进一步的实验研究包括特异性序列的克隆、转染等提供了条件。本文资料显示，MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3 mRNA的表达率分别为48.2%、32.1%、53.6%，与欧洲学者的报道相比，MAGE-1和MAGE-3较高，MAGE-2相近[6]；而日本学者的研究证实，MAGE-1和MAGE-3在NSCLC组织中的表达率分别为32.7%和41.8%[7]，比本文资料显示的表达率低，说明我国NSCLC患者更适宜以MAGE-1和MAGE-3基因作为免疫治疗的攻击靶点。关于此3种基因的具体表达形式，本文结果表明，3种基因同时表达以及MAGE-1、MAGE-3基因同时表达所占的比例最高，而没有一例标本单独表达MAGE-2基因，这一结果与Hiroshi等[8]对食管癌的研究结果相似。由于对MAGE基因的确切功能尚存争议，因此目前还没有准确的依据对这一结果作出合理解释。

MAGE基因的发现有力地推动了人类肿瘤特异性免疫的研究，以该基因家族成员为疫苗对肿瘤进行免疫治疗不断取得新进展[9]。抗原的识别、加工、提呈以及T细胞的致敏、激活和扩增依赖于抗原提呈细胞 （APC）的参与和作用。树突状细胞（dendritic cells，DC）是功能最强的 APC，DC 能摄取和加工抗原，表达高水平MHC分子、共刺激分子、粘附分子并分泌高水平Th1型细胞因子IL-12，故有很强的抗原提呈能力，能有效激发T细胞应答，将MAGE基因家族编码的抗原与DC联合应用已成为肿瘤免疫治疗的新方法[10]。

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