徐 怡，陈光明，宓现强

(1.上海理工大学医疗器械与食品学院，上海 200093;2.中国科学院上海高等研究院，上海 201210)

恶性肿瘤是一种死亡率很高的疾病，2005年全球死亡人数5800万中死于癌症的760万，占总数13%[1-2]。据世界卫生组织最近发表《世界癌症报告》说，今后数年将是全球癌症高发年份，如各国不采取紧急措施，到2020年全世界癌症发病率将比现在增加50%，全球每年新增患者人数将达1500万人。解决肿瘤高死亡率的途径之一是对肿瘤进行有效的控制和预防，而控制和预防最大的难题是如何能尽可能早的发现肿瘤，从而针对性的采用最有效的手段进行治疗。

肿瘤患者死亡率的不断升高，使得越来越多的研究人员致力于肿瘤研究，在其诊断和治疗方面取得了不少进展，其中肿瘤诊断方面，miRNA作为一种新的肿瘤标志物是肿瘤诊断研究的热点。

一、肿瘤标志物的新热点——miRNA及其检测技术

1.miRNA简介及优势 miRNA(microRNA，微小RNA)是在真核生物中发现的一类内源性的非编码小分子RNA，存在于不同生物中，在Drosha R Nase的作用下由pri-miRNA剪切成为70～100个核苷酸长度的具有茎环结构的pre-miRNA，pre-miRNA在Dicer酶作用下被剪切成19～25个核苷酸长度的成熟 RNA，即 miRNA[3]。成熟miRNA通过与目标mRNA的3'端非编码区(3'untranslated region，3'UTR)特异性互补，导致mRNA翻译受到抑制[4]。miRNA具有广泛的基因调节功能，据统计miRNA调节了人类30%基因功能[3]，参与了一系列生命活动，包括细胞增殖及凋亡、器官形成、造血过程、发育进程等，与肿瘤的发生、诊断、治疗和预后等有着密切关系，肿瘤中超过50%的miRNAs基因位于染色体脆性位点或染色体扩增、缺失或转位区域[5]，相比于蛋白质标志物，miRNA表达异常出现的更早(图1)，对早期诊断更加有利，也更适合作为作为肿瘤诊断标志物，从而成为研究热点之一[6-8]。

图1 肿瘤过程及生物标志物的确定

肿瘤标志物检测是真正能够实现肿瘤早期诊断的方法，miRNA的诊断优势从以下实验事例中有充分体现，Maitra A等[9]的一项研究表明血清中miRNA能很好的区分肿瘤患者和健康人群，这为在血浆或血清中检查miRNA表达的变化情况，为基于血液样品的人类癌症检测提供了依据。Mitchell，P.S 等[10]试图通过实验方法确定来源于血浆和血清样本的miRNA是否会有本质的不同，该实验组的检测样本来自同一患者的同一次抽血。实验结果表明无论对血浆还是血清样本进行检测，miRNA都可以作为基于血液检测的稳定的标志物。Keller等[11]对临床454例不同疾病患者血清样本进行芯片分析，包括肺癌、前列腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胃癌、肾母细胞瘤、胰腺肿瘤等肿瘤患者以及对照个体。结果显示863种miRNAs中有多达62种miRNA在6种疾病中表达下调;24种miRNA在14种疾病中表达下调;同时也有121种miRNA在所有的14种疾病中正常表达。这一研究结果说明miRNA对于肿瘤有很好的显示作用，使得根据血清中miRNA的表达情况确定患者患病情况成为可能。Hennessey，P.T等[12]针对非小细胞肺癌的实验结果发现血清中的2种miRNA:miR-15b和miR-27b的不同表达情况能够很好的区分非小细胞肺癌和健康人群，并且特异性很高。该研究结果不仅证实了前人对于循环miRNA对筛查非小细胞肺癌有很重要的作用[12-14]的结论.同时也充分显示血清中miRNA的不同表达情况对于非小细胞肺癌来说具有很高的诊断价值，并且可能成为患者确诊前的最有效的诊断依据。上述几例实验充分证明miRNA是特异性很强的肿瘤早期诊断标志物。Rui Liu等[15]用197例胰腺癌血清样本，对胰腺癌早期标志物进行研究，结果显示该研究组所选择的7种miRNA同时检测的准确率为86.3%，而单独的糖类抗原(CA)19-9检测准确率为56.4%，癌胚抗原(CEA)仅为36.4%。这充分说明miRNA相比于蛋白类标志物具有优势，也从另一方面说明多个靶分子同时检测的重要性。

从上述实验事例可以看出miRNAs表达异常对肿瘤有很好的鉴别作用[5，16-17]。这为肿瘤实现早期诊断提供了方向。miRNA不仅在肿瘤的发生发展过程中起到了重要的作用，可以作为癌症诊断和预后判断的重要标志物。同时miRNA具有以下五大优点:(1)miRNA在正常人外周血中表达稳定且可以稳定存在，无显著的个体差异[18-21];(2)血清或血浆中miRNA在室温下孵育24 h或者以上、反复冻融(可高达8个冻融周期)、过酸、过碱、甚至煮沸条件下不易降解[22-28，10];(3)miRNA 表达水平的变化与恶性肿瘤的病理过程密切相关;(4)血清中miRNA的异常表达可作为肿瘤细胞存在的直接证据，具有很好的生物学标志物价值[29-31];(5)miRNA相比于蛋白标志物不仅检测准确率更高，且更易于实现多组分同时检测，优越性明显。

2.生物信息学在miRNA标志物发现及优化中的作用 近年来随着对miRNA研究的增多，不同物种中数以百计的miRNA已直接由克隆技术和计算方法确定，但是仍有很多miRNA由于相对分子质量较小或者序列特异性等问题不能仅仅依靠序列信息就可以确定，而是需要了解miRNA前体的结构信息才可以确定[32-33]。生物信息学在这方面是一种非常有价值的研究方法[34]。生物信息学通过计算机和信息技术结合，对生物实验数据进行分析和计算，对于实验方法实验结果是一种非常有价值的补充。Mizuguchi，Y等[35]研究表明通过生物信息学所确定的miRNA相比于个体miRNA研究或者其他临床病理研究等方法，对于高危人群的预后状况分析效果更好。因此生物信息学技术能够成为生物知识和临床治疗之间相结合的桥梁。生物信息学及其相关技术能够促进新的靶点的快速识别，从而可以推进研究更快的进入到实验验证阶段[36]。

同时生物信息学在多靶点的确定方面有着不可忽视的作用。目前临床上对于肿瘤标志物诊断方法仍多为单组份检测，而单组份检测存在特异性不高、灵敏度不强等缺陷，多组分同时检测恰恰能够克服单组份检测的缺陷，灵敏度和特异性都有很大的提高。本文前面所提到Rui Liu等的实验数据也说明多组分相比于单组份的优势，而寻找同时检测的多组分靶点也成为了非常重要的一部分，生物信息学对于新型标志物miRNA的确定以及多靶点的组合方面有重要作用，根据生物信息学计算结果结合相关验证实验可以更快的确定肿瘤标志物最佳组合，从而更快的推动肿瘤标志物多组分同时检测。

3.用于肿瘤早期诊断的miRNA检测技术 在肿瘤的早期诊断中，除了标志物的选择和检测样本的确定外，检测方法也是提高肿瘤检测特异性的一个很重要方面。目前miRNA的检测有以下几种方法，荧光定量聚合酶链反应(RTPCR)、荧光原位杂交(FISH)等。其中RT-PCR检测方法最为常用，主要分为探针法和染料法2种，由于miRNA在血清中浓度低，因此反应所需循环次数多，持续时间长。目前国内肿瘤核酸定量检测试剂盒仍处于科学研究阶段;FISH相对简单，国内外已有肿瘤组织细胞检测试剂盒，然而miR-NAs原位检测系统相对较少，主要的原因是低拷贝、片段小。

分子信标检测技术是能够实现对miRNA进行简便快速检测的检测方法。分子信标是一段寡核苷酸，主要由4个部分组成:环、茎、荧光基团和猝灭基团，分子信标具有能够很好的和靶点miRNA特异性结合的特点，因此只有当检测样本中存在检测靶点，分子信标才会与之结合，与此同时，分子信标荧光基团和猝灭基团打开，从而可以检测到荧光的存在。这一特点使得检测的特异性大大提高。普通分子信标常用的荧光基团和猝灭基团为传统有机染料，但是有机染料存在着吸收光谱较宽，而发射光谱较窄、抗光漂白性较差等缺点[37]。为此，近年来很多学者和专家开始更多的关注量子点技术。

量子点是一种无机纳米材料，具有发光强度强，经过测定单个量子点比有机染料明亮大概10～20倍[38-39]、且具有发射波长可以由自身尺寸大小变化而变化等优点，通过不同尺寸的量子点与分子信标结合能够实现对多种miRNA的同时检测。将量子点和分子信标技术结合，能够使两者优势互补，非常便于实现建立快速、简便、高效的肿瘤标志物早期诊断新技术，对肿瘤的早期诊断的实现有重大的意义。

三、总结

综上所述，肿瘤诊断方面影像学有不可忽视的作用，但是由于自身局限性很难实现早期诊断，而传统标志物诊断由于特异性不强，灵敏度不高而影响诊断效果。检测标志物、检测对象及检测方法共同决定了恶性肿瘤的早期诊断效果，miRNA、生物信息学以及分子信标检测技术三者相结合，对于实现恶性肿瘤早期诊断有巨大的推动作用。

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