张 佳 张安龙 景立明

(1.包头市核新环保技术有限责任公司，内蒙古包头，014000;2.陕西科技大学，陕西西安，710021)

一级沉降、二级生化处理是目前降解造纸废水比较成熟的技术，可在一定程度上大幅度降低造纸废水的污染负荷［1］，但随着制浆造纸废水排放指标的不断严格，一二级处理已不能满足废水出水水质要求，因此废水的深度处理逐渐成为研究的热点［2］。漆酶是含有4个铜离子的多酚类单电子氧化酶，可以氧化如氯代酚、多氯联酚、二氯苯胺、杀虫剂、染料等芳香族化合物，在漆酶介体 (HBT等)存在下，漆酶还可以催化降解与木素相关的二苯基甲烷及二恶英等［3-5］。因此漆酶被广泛应用于食品加工、造纸、皮革等工业领域，尤其是在造纸废水的木素脱除过程中发挥着重要的作用。但是酶一旦从细胞中分离出来，其活性会迅速下降，并且在实际应用中对外界环境的变化非常敏感，因此限制了漆酶的广泛使用。张安龙等人［6］采用明胶对漆酶进行固定化，固定后的漆酶用于深度处理麦草浆造纸废水，在最佳反应条件下，废水色度去除率达70%，COD去除率在65%以上。本实验采用环氧化聚乙烯醇 (PVA)载体对漆酶进行固定化，确定了漆酶固定化的最佳工艺条件，以酶活来反映固定化效果，以色度去除率反映固定化漆酶的工程应用可行性。

1 实验

1.1 水样特性

水样取自奥辉纸业烧碱法麦草浆制浆的二沉池出水，指标为:pH 值 6.9 ～7.8，CODCr为 230 mg/L，BOD5为33.6 mg/L，可生化性 (BOD/COD)为0.15。

1.2 实验仪器及药品

UV759紫外可见分光光度计;水浴恒温振荡器;数字式酸度仪;BODTrakTM型BOD测试仪，HACH公司;光照培养箱。

游离漆酶，购买于某生物公司成品粗酶;聚乙烯醇 (PVA);戊二醛;环氧氯丙烷;二甲基亚砜;愈创木酚;丁二酸;磷钼杂多酸。以上药品均为分析纯。

1.3 实验方法

1.3.1 环氧化PVA的制备

配置质量分数为10%的PVA水溶液。称取100 g PVA水溶液，加入35 mL、体积分数为25%的戊二醛，混合均匀，用HCl调节PVA水溶液pH值为1～2，20℃下搅拌均匀，成凝胶状后将其放入60℃水浴中反应3 h。反应结束后将块状凝胶打碎成颗粒状，粒状PVA经丙酮洗、水洗，过滤后称取10.0 g PVA颗粒，加入10.0 mL环氧氯丙烷和10.0 mL二甲基亚砜溶剂，以NaOH为催化剂，控制反应pH值为11～12，反应一定时间后用2 mol/L的HCl滴定至中性，再用丙酮与清水洗净后得到固定化载体——环氧化PVA。环氧化反应主要方程式见式 (1)［7］。

1.3.2 漆酶的固定化

称取5 g环氧化PVA载体，加入一定量液态漆酶和10 mL pH值一定的HAc-NaAc缓冲溶液，35℃水浴中以150 r/min转速振荡一定时间后获得固定化漆酶，用缓冲溶液洗涤至洗出液中无酶蛋白，4℃下保存。漆酶固定化原理见式 (2)。

1.4 分析方法

1.4.1 固定化漆酶酶活的测定

底物的配制:将137.4 μL愈创木酚 (分析纯)和4.5 g丁二酸加入800 mL蒸馏水中，用NaOH溶液调节pH值至4.5，用蒸馏水定容至1 L。

取4 mL底物于试管中，加入1 g固定化漆酶，混合均匀后于30℃水浴反应30 min，测定其在波长465 nm下吸光度 (OD465)值。对照管中加1 g未固定化漆酶的环氧化PVA载体和4 mL底物。酶活计算公式如式 (3)所示，定义1 min内转化1 μmol底物所需的固定化漆酶量为1个漆酶活力单位 (U/g)［8］:

式中，ε465(愈创木酚)=1.21 × 104L/(mol·cm);Δt为酶反应时间，min;ΔOD为吸光度的变化值;V为比色皿中溶液的总体积，mL;m为参加反应的固定化漆酶的质量，g;N为酶液稀释倍数;L为比色皿光径，cm。

在漆酶固定化条件的优化实验过程中，使用相对酶活的概念，即在优化某个条件的各水平梯度实验中，将最优条件下的酶活作为100%，其他水平梯度的酶活为相对于100%酶活的活性［9］。

1.4.2 色度去除率的测定

色度去除率的测定采用紫外分光光度法，调节废水pH值为7.6，用蒸馏水或者去离子水作对照，测定其在波长465 nm下的吸光度值［10］。在浓度较低时废水的色度与其最大吸收波长的吸光度值成正比，可以用废水在该处的吸光度变化来反映废水色度的变化。色度去除率 (F)的计算公式见式(4)。

式中，A0表示初始时刻废水在特征波长处的吸光度值;A表示 t时刻废水在特征波长处的吸光度值。

2 结果与讨论

2.1 漆酶用量对固定化效果的影响

取1.0 g环氧化PVA载体，分别加入不同用量的液态漆酶和HAc-NaAc缓冲溶液，用量如表1所示，通过相对酶活的大小来确定漆酶最佳用量。

由表1可知，当环氧化PVA载体用量与漆酶用量的比值为1∶1时可以得到相对酶活较高的固定化漆酶，由于在此过程中同时改变了缓冲溶液的用量，因此下一步继续讨论缓冲溶液用量对固定化效果的影响。

表1 漆酶用量对酶活的影响

2.2 缓冲溶液用量对固定化效果的影响

取5份环氧化PVA载体各5.0 g，分别加入0、2.5、5.0、7.5、10.0 mL HAc-NaAc 缓冲溶液，然后分别向每份环氧化PVA载体中加入5.0 mL漆酶，放入35℃水浴恒温振荡器中振荡4 h，得固定化漆酶，测定不同缓冲溶液用量条件下得到的固定化漆酶的相对酶活，得出缓冲溶液用量与相对酶活的变化曲线如图1所示。

图1 缓冲溶液用量对酶活的影响

由图1可以看出，当缓冲溶液用量大于等于5.0 mL时，得到的固定化漆酶相对酶活较高，继续增大缓冲溶液用量几乎对酶活没有影响。由于固定化过程一直处于恒温环境，所以温度对酶活的影响可以不考虑。下面主要研究不同反应时间所对应的pH值变化情况，通过pH值的变化趋势找出影响固定化漆酶酶活的原因。

通过全程监测pH值变化情况，得到pH值随反应时间变化曲线如图2所示。从图2可以看出，当缓冲溶液用量较少时，体系的pH值在反应时间内发生了很大变化，结合图1可说明影响相对酶活大小的因素为体系pH值的变化。从图2可以看出，当缓冲溶液用量为7.5 mL或10.0 mL时，反应体系的pH值在反应期间能维持在某一固定值，使得相对酶活较高。从图2亦可看出，当pH值为4.0左右时，相对酶活较高。为保持反应所需的最佳pH值，确定缓冲溶液的用量控制在10.0 mL，使可获得最佳的固定化效果。

图2 不同反应时间下pH值的变化趋势

2.3 固定化时间对漆酶活性的影响

分别称取5.0 g环氧化PVA载体5份，每份加入5.0 mL 漆酶、10.0 mL pH 值 4.0 的 HAc-NaAc缓冲溶液，35℃下分别振荡2、3、4、5、6 h，测定不同振荡时间下漆酶的活性，得固定化漆酶的相对酶活随时间变化曲线如图3所示。

图3 固定化时间对漆酶活性的影响

由图3可知，当固定化时间为5 h时得到的固定化漆酶相对酶活最高。分析其原因可能为载体本身的环氧固载量决定了所能固定的漆酶的量。反应初始，漆酶逐渐固定到载体上，但随着时间的继续延长，一方面环氧固载量有限，不能固定更多的漆酶;另一方面，漆酶在不同温度下具有不同的热稳定性，在35℃下保温超过一定时间会导致部分酶活损失，所以本实验确定漆酶的最佳固定化时间为5 h。通过接下来的实验来验证保温时间和固定化温度对酶活的影响程度，亦即漆酶的热稳定性。

2.4 保温时间对漆酶活性的影响

将酶液在25、35、45、55、65、75℃下保温一定时间，测定不同保温时间下漆酶的剩余活性。以未经保温的漆酶酶活为100%，得不同温度下漆酶的相对酶活随保温时间的变化曲线如图4所示。

由图4可以看出，随着保温时间的延长，漆酶的活性都呈下降趋势，只是对于不同的温度，其酶活下降的幅度有所不同。因此可以认为当温度低于35℃时，漆酶能够维持相对较高的漆酶活性。

2.5 固定化温度对固定化漆酶活性的影响

取10.0 g PVA颗粒，加入10.0 mL环氧氯丙烷和10.0 mL二甲基亚砜，分别在20、30、35、40、50、60℃下固定化4 h，得固定化漆酶相对酶活随温度变化曲线如图5所示。

由图5可知，酶活受温度影响很大，在较低的温度范围内酶活随温度的升高而升高，但超过35℃时酶活开始下降。分析原因为漆酶的化学本质为蛋白质，温度过高导致蛋白质变性，漆酶失活，因此高的固定化温度会导致漆酶失活，而较低的温度又会影响催化活性，从而降低固定化漆酶的相对活性。综合考虑，本实验确定最佳固定化温度为35℃。

表2 固定化漆酶对废水色度的去除

3 固定化漆酶深度处理草浆中段废水二沉池出水

本实验取1 L奥辉纸业烧碱法麦草浆制浆二沉池出水，CODCr为230 mg/L，BOD5为33.6 mg/L，加入1.5 g固定化漆酶、5 mg磷钼杂多酸介体、5 mg Cu2+，在室温 (16℃左右)条件下曝气反应6 h，控制反应体系的pH值分别为4.0和6.5，测定不同pH值反应条件下固定化漆酶对色度去除率的影响，结果如表2所示。

由表2可知，用该固定化漆酶处理草浆二沉池出水，当反应体系pH值为4.0时，其色度去除率可达62.9%，且 BOD5从初始的 33.6 mg/L 提升到49.6 mg/L，提高了47.6%，CODCr从 230 mg/L 降低为215 mg/L，废水可生化性由0.15提高到0.23。固定化漆酶处理过的废水再经曝气生物滤池或其他生物方法进行处理，可在一定程度上降低出水CODCr浓度和色度。

4 实验发现的问题

该实验获得的固定化漆酶对CODCr的去除效果不是很明显，并且在放置36 h后，酶活即达到相对酶活的1/2以下，不再具备降解能力，因此接下来的实验需进一步分析影响固定化漆酶难以降低CODCr的因素，从而研究出最佳的漆酶固定化条件，使废水的各个指标均达标排放，提高该固定化漆酶的实用性和环保性。抑或研究固定化漆酶对废水可生化性的改变能力，通过与其他生物方法的结合达到深度处理废水的目的。

该实验在固定化漆酶反应过程中给予一定的曝气量，使固定化漆酶处于悬浮状态，可以通过吹脱的方式去除一部分沉积在固定化漆酶表面的木素，但随着反应时间的延长，木素始终会覆盖到固定化漆酶的表面上，导致酶活不能很好地发挥。接下来研究重点可以转向固定化漆酶表面木素的去除方面。

5 结论

5.1 将漆酶进行固定化，是降低漆酶处理废水成本的关键，以聚乙烯醇 (PVA)为载体固定化漆酶，得到最佳固定化条件为:固定化温度T=35℃，反应pH值4.0，环氧化 PVA载体 (g)、漆酶 (mL)和HAc-NaAc缓冲溶液 (mL)的投加比例为1∶1∶2的条件下获得的固定化漆酶具有较高的酶活。

5.2 固定化漆酶处理麦草浆制浆二沉池出水，在反应体系pH值4.0、反应6 h后，废水的BOD增大了47.6%，可生化性得到提高，色度去除率达62.9%。5.3 该方法合成的固定化漆酶在放置36 h后酶活即达到相对酶活的1/2以下，不再具备降解能力。

［1］Li Songli，Hong Wei，Yang Haitao，et al.Advanced Treatment Technology of Papermaking Comprehensive Wastewater［J］.China Pulp ＆Paper，2006，25(6):71.

李松礼，洪 卫，杨海涛，等.制浆造纸综合废水深度处理技术［J］.中国造纸，2006，25(6):71.

［2］Hong Wei，Feng Xiao-jing，Jiang Wen-qiang.Research on advanced treatment of papermaking wastewater［J］.China Pulp ＆ Paper，2006，25(2):65.

洪 卫，冯晓静，蒋文强.造纸中段废水深度处理的研究［J］.中国造纸，2006，25(2):65.

［3］Yaropolov A I，Skorobogat’ko O V，Vartanov S S，et al.Laccase:properties，catalytic mechanism，and applicability［J］.Appl.Biochen.Biotechnol，1994，49:257.

［4］Nelson Duran，Elisa Espsito.Potential applications of oxidative enzymes and pH值enoloxidase like compounds in wastewater and soil treatment:a review［J］.Applied Catalysis B:Environment，2000，28:83.

［5］Li Kai-chang，Xu Feng，Karl Erik L，et al.Comparison of fugal laccases and redox mediators in oxidation of nonphenolic lignin model compound［J］.Applied and Environmental Microbiology，1999，65:2654.

［6］Zhang Anlong，Pan Hongyan.Research on Advanced Treatment of Wheat Straw Pulp Wastewater by Immobilized Laccase［J］.Environment Science and Technology，2010，33(12):274.

张安龙，潘洪燕.固定化漆酶深度处理麦草浆造纸废水的研究［J］.环境科学与技术，2010，33(12):274.

［7］Xu Jiankuan，Yuan Zhi，He Binglin.The Preparation of Crosslinked Ploy(Vinyl Alcohol)Bead with Epoxy Group［J］.Ion Exchange and Adsorption，2002，18(1):64.

徐建宽，袁 直，何炳林.环氧化交联聚乙烯醇球的制备［J］.离子交换与吸附，2002，18(1):64.

［8］Zhao Liangliang，Chen Bin，Li Yanrong，et al.Enzymology Characteristics of Constitutive Form Laccase Derived from Ganoderma Lucidum［J］.Northern Horticulture，2010(5):138.

赵亮亮，谌 斌，李燕荣，等.红芝组成型漆酶酶学性质的研究［J］.北方园艺，2010(5):138.

［9］Zhao Min，Meng Qinghui，Wang Yan，et al.Synthesis of Crosslinked Polythylene Glycol Diacrylates and Their Application as Supports for Laccase Immobilization［J］.Transactions of China Pulp and Paper，2009，24(3):61.

赵 敏，孟庆辉，王 炎，等.交联聚乙二醇二丙烯酸酯的制备及对漆酶的固定化研究［J］.中国造纸学报，2009，24(3):61.

［10］Kapdan，Kargi F.Effect of environmental conditions on biological decolorization of textile dyestuff by C.versocolor［J］.Enzyme and Microbial Technology，2000，26(5):381. CPP