鞠亚菲 隋牮箐 宋明全 姜相君#

青岛大学医学院1(266000) 青岛大学医学院附属青岛市市立医院消化内二科2

胃癌是严重威胁人类健康的常见消化道肿瘤，近年其发病率呈逐渐下降的趋势，但仍是目前第4常见的恶性肿瘤，且死亡率位居所有恶性肿瘤的第二位［1］。我国是胃癌的高发区［2］，发病年龄以中老年居多［3］。目前胃癌的病因尚未完全阐明，涉及多种因素及其相互的作用。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)是人类基因组DNA序列可遗传变异的主要形式之一，可决定人类疾病的易感性，目前已被广泛用于疾病病因探索、治疗研究、预后评估等反映个体间易感性差异的研究。Runt相关转录因子3(Runt-related transcription factor 3，RUNX3)是近年新发现的肿瘤抑制基因，其基因多态性与亚洲人群胃癌的发生可能相关。本研究通过采用DNA直接测序法检测RUNX3基因rs2236852位点的基因型，旨在探讨该位点多态性与中国汉族人群胃癌发病的关系，以期初步了解rs2236852多态性与我国胃癌发病的关系。

对象与方法

一、研究对象

选取2011年3月～2013年4月青岛大学医学院附属青岛市市立医院确诊的310例胃癌住院患者，并排除有胃部疾病以及肿瘤家族史者。同时从青岛市市立医院体检中心选取同期327名健康体检者作为对照组。标本采集均获得研究对象的知情同意，本研究方案经青岛大学医学院伦理委员会审批通过。

二、研究方法

1.基因组DNA提取:取EDTA抗凝静脉血2 mL，采用血液基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)［天根生化科技(北京)有限公司］提取基因组DNA，紫外分光光度计测定DNA浓度，－20℃冰箱保存。

2.聚合酶链反应(PCR)法:以RUNX3基因组序列为依据，设计该基因rs2236852位点PCR引物，由Invitrogen公司提供。引物上游序列:5’-GAG GTG GCA GCC CTG CCA TA-3’，下游:5’-TGG AGT GGC TCC CCT CTT TCT G-3’，片段大小120 bp。PCR 反应体系为 25 μL，含 100 μg/L DNA 模板，10 × PCR 缓冲液 2.5 μL，50 mmol/L MgCl20.8 μL，10 mmol/L dNTP 混合液0.5 μL，5 μmol/L 正反向引物各 1 μL，Platinum®Taq DNA 聚合酶(Invitrogen公司)0.2 μL，加入灭菌蒸馏水补足至25 μL。上ABI9700 PCR仪(美国 ABI公司)进行扩增反应，反应条件:94℃预变性5 min;94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35个循环;72℃终延伸5 min。取PCR产物2 μL行2%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物。

3.DNA直接测序分析基因型:确定目的片段扩增成功后，加入POP-6胶，应用ABI PRISMTM3700 DNA Analyzer进行测序。

三、统计学分析

应用SPSS 13.0统计软件，所得数据以百分率表示。基因型频率先行Hardy-Weinberg遗传平衡检验，组间比较采用χ2检验，rs2236852位点基因型与胃癌发病风险关系的分析采用Logistic回归分析，计算OR值及其95%CI。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、一般资料

在研究期间纳入的310例胃癌患者中，男206例，女104例，平均年龄(55.7±14.2)岁。327名对照者中，男219名，女108名，平均年龄(56.4±14.6)岁。两组间性别构成(P=0.889)、年龄(P=0.891)、吸烟状况(P=0.055)和饮酒状况(P=0.627)相比差异均无统计学意义，说明样本具有可比性。

二、rs2236852位点基因型

琼脂糖凝胶电泳结果表明RUNX3基因rs2236852位点PCR扩增产物与目的片段大小一致，扩增成功。

对照组测序结果表明RUNX3 rs2236852基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡，表明样本具有群体代表性。该位点AA、GA、GG基因型测序结果见图1。

三、RUNX3 rs2236852基因型与胃癌发病风险的关系

胃癌组与对照组的RUNX3 rs2236852基因型分布频率相比差异有统计学意义(P＜0.05)。与AA基因型相比，GG基因型能显著增加胃癌的发病风险(OR=2.46，95%CI:1.60～3.78)，差异有统计学意义;AG基因型虽能提高胃癌的发病风险，但差异无统计学意义(OR=1.58，95%CI:0.99 ～2.54)(见表 1)。

图1 RUNX3 rs2236852位点各基因型测序图

表1 RUNX3基因rs2236852位点基因型与胃癌发病风险的关系

讨 论

RUNX3位于染色体1p36.1，长约67 kb，含有 P1、P2两个启动子以及6个外显子，编码由415个氨基酸残基组成的核心结合因子(core binding factors，CBFs)。RUNX3蛋白是由α、β两个亚单位构成的异二聚体，α亚单位含有一段由128个氨基酸组成的高度保守域Runt结构域(runt domain，RD)，能特异性识别目的基因并与之结合［4］。RUNX3作为转化生长因子(TGF)信号转导通路中非常重要的调节因子，可与TGF途径成员共同调控细胞的生长、发育和凋亡［5］。RUNX3基因遗传变异与肿瘤的研究目前较少见。Zhang等［6］的研究发现RUNX3基因rs2236852位点GG基因型能显著增加膀胱癌的发病风险。

RUNX3基因多态性与胃癌发生关系的研究结论目前未取得统一。Hishida等［7］报道了 RUNX3基因外显子 1 rs6672420位点和内含子rs760805位点T/A多态性与日本胃癌患者的关系，结果显示幽门螺杆菌感染者中，与TT基因型相比，rs760805位点携带A等位基因(TA、AA、TA+AA基因型)可明显促进胃萎缩的发生(调整OR值分别为1.51、1.59和1.53)，但两个位点的多态性均与胃癌无明显关系。胡胜等［8］的研究发现RUNX3基因C364T突变与胃癌发生无关。Keller等［9］的研究分析了RUNX3基因多态性与34例德国家族性胃癌患者(20例弥散型，9例肠化生型和5例混合型)遗传倾向的关系，但未发现两者相关。Wu等［10］对RUNX3 10个标签SNPs与我国胃癌发生风险的关系进行了分析，发现3个标签SNPs的携带与胃癌风险增高有关，分别为SNP3 rs11249206 CC基因型(与TT基因型相比，调整OR=1.75，95%CI:1.03 ～ 2.99)、SNP7 rs760805 AA 基因型(与 TT 基因型相比，调整 OR=1.82，95%CI:1.14 ～2.92)、SPN8 rs2236852 GG基因型(与AA基因型相比，调整OR=1.69，95%CI:1.05 ～ 2.72)。本研究发现，胃癌组 RUNX3 rs2236852基因型分布频率与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05)。与AA基因型相比，GG基因型能显著增加胃癌的发病风险(OR=2.46，95%CI:1.60 ～3.78);AG 基因型可增加胃癌发病风险，但差异无统计学意义(OR=1.58，95%CI:0.99 ～2.54)。

综上所述，本研究结果初步显示RUNX3基因rs2236852位点GG基因型可能与中国汉族人群的胃癌发病风险增加有关，但该结论尚需今后行更大样本、设计更严格的多中心研究进一步验证。

1 Crew KD，Neugut AI.Epidemiology of gastric cancer［J］.World J Gastroenterol，2006，12(3):354-362.

2 Yang L.Incidence and mortality of gastric cancer in China［J］.World J Gastroenterol，2006，12(1):17-20.

3 谢英标主编.胃癌防与治［M］.西安:西安交通大学出版社，2010:9-11.

4 Bangsow C，Rubins N，Glusman G，et al.The RUNX3 gene--sequence，structure and regulated expression［J］.Gene，2001，279(2):221-232.

5 Derynck R，Akhurst RJ，Balmain A.TGF-beta signaling in tumor suppression and cancer progression［J］.Nat Genet，2001，29(2):117-129.

6 Zhang Z，Wang S，Wang M，et al.Genetic variants in RUNX3 and risk of bladder cancer:a haplotype-based analysis［J］.Carcinogenesis，2008，29(10):1973-1978.

7 Hishida A，Matsuo K，Goto Y，et al.Significant association of RUNX3 T/A polymorphism at intron 3(rs760805)with the risk of gastric atrophy in Helicobacter pylori seropositive Japanese［J］. JGastroenterol， 2009， 44 (12):1165-1171.

8 胡胜，宋启斌，柯玉华，等.RUNX3基因364位点C→T突变与胃癌关系的研究［J］.中国病理生理杂志，2005，21(10):1905-1908.

9 Keller G，Vogelsang H，Becker I，et al.Germline mutations of the E-cadherin(CDH1)and TP53 genes，rather than of RUNX3 and HPP1，contribute to genetic predisposition in German gastric cancer patients［J］.J Med Genet，2004，41(6):e89.

10 Wu D，Tian Y，Gong W，et al.Genetic variants in the Runt-related transcription factor 3 gene contribute to gastric cancer risk in a Chinese population［J］.Cancer Sci，2009，100(9):1688-1694.