周育苗，吴 炯，刘小利，李雅国

脑梗死是发病率较高的疾病之一，目前公认的有效治疗方法是溶栓治疗，但由于各种原因，仅有10%～18%的急性脑梗死患者接受了溶栓治疗［1］。干细胞具有自我复制和多向分化的潜能，在神经系统领域的应用越来越受到关注。业已证明，在成人脑室下区和海马齿状回存在神经干细胞，当大脑细胞受损时可能迁移至病灶区并分化为神经元和胶质细胞［2］，但这种自我挽救的能力非常有限。可喜的是，这种神经发生可以被一些外源性信号因子增强，如成纤维生长因子、血管内皮生长因子、脑源性营养因子和粒细胞集落刺激因子 (granulocyte colony － stimulating factor，G － CSF)［3］。

目前已有较多的动物实验证实皮下注射G－CSF可减小脑梗死的体积并改善预后［4］，但临床试验报道并不多;因各试验G－CSF的剂量不一，从发病到入组的时间以及基线脑梗死体积不同等因素，导致各试验的结论不一致，需进一步探索。本研究在现有试验的基础上观察G－CSF治疗急性脑梗死的有效性和安全性及外周血细胞数的变化。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择2011—2012年在我院神经内科住院的患者。病例入选标准:首次发生的大脑中动脉区梗死，发病7 d内，瘫痪侧肢体肌力≤Ⅲ级，MRI检查示梗死体积＞15 ml。病例排除标准:因意识障碍或失语不能配合者，入组前伴感染者〔可能导致白细胞计数 (WBC)升高〕，伴血液系统疾病或凝血功能异常者 (包括血小板计数减少)，脑梗死伴出血者，重要脏器功能衰竭者，恶性肿瘤者，因各种原因不能应用G－CSF者，住院期间发生严重感染者。本试验符合浙江医院伦理委员会制定的伦理学标准，受试者均充分了解整个试验过程及可能出现的不良反应，并签署知情同意书。

1.2 试验设计及给药方案 采用前瞻性研究，按照随机数字表法分为试验组 (G－CSF组)和对照组，负责随访的课题组成员对分组情况不知情。两组受试者均按照2010年中华医学会神经病学分会制定的卒中指南给予常规治疗。G－CSF组在常规治疗的基础上皮下注射G－CSF(吉粒芬，杭州九源基因工程有限公司，批号20110204)300 μg/次，2次/d(每天8:00、20:00)，共5 d;如果WBC达到或超过50×109/L，则改为1次/d，皮下注射。对照组在常规治疗的基础上给予0.9%氯化钠溶液2 ml皮下注射，2次/d(每天8:00、20:00)，共5 d。

1.3 实验室检查指标 G－CSF组每天6:00抽血，连续8 d，按给药时间标记为第1～8天。因抽血时间是在6:00而给药时间是在8:00，所以第1天的血标本是给药前的，第2天的血标本是给药1 d后的，以此类推，第6天的血标本是给药5 d后的。其他检测指标为血常规、凝血功能+D－二聚体、肝肾功能和胞数。因为皮下注射0.9%氯化钠溶液不会对血常规、凝血功能及肝肾功能等指标产生影响，所以对照组仅在第1天检查上述指标。

1.4细胞数计数方法 按照ProCOUNT试剂盒 (Becton Dickinson公司生产，美国)说明书操作，简述如下:使用反向取样技术向2支TruCount管中分别加入细胞数检测试剂和对照试剂各20 μl，然后各加入全血标本50 μl，避光室温孵育15 min，随后各加入450 μl FACS红细胞裂解液 (Becton Dickinson公司生产，美国)，避光室温孵育30 min后放入FACSC alibur流式细胞分析仪 (Becton Dickinson公司生产，美国)，程序设定好后仪器会自动给出细胞数的绝对值(个/μl)。

1.5 临床观察指标 (1)安全性:记录整个试验过程中发生的任何不良事件，重点关注以下信息:肝肾功能，血小板计数，凝血功能，发热，皮疹，胃肠道反应，血栓性栓塞事件，肌肉、关节和骨骼疼痛。(2)有效性:比较两组入组时及入组1、2、3个月时美国国立卫生研究院卒中量表 (NIHSS)评分和日常生活能力评定量表 (Barthel指数)评分。Barthel指数评分分级标准:75～90分为轻度残疾，50～70分为中度残疾，25～45分为重度残疾;0～20分为极重度残疾。

1.6 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件包进行统计学分析，连续性资料以 (±s)表示，非连续性资料 (如年龄)用中位数 (四分位数间距)〔M(QR)〕表示，计数资料用相对数表示。计量资料的组间比较采用成组t检验 (数据均服从正态分布)，组内比较采用重复测量的方差分析。等级资料的比较采用秩和检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基线资料 最终纳入统计的受试者共82例，对照组42例，G－CSF组40例，两组均完成3个月随访，无死亡及脱落者。平均住院时间为 (36±5)d，所有患者病情稳定后行正规康复治疗。两组患者的基线资料间差异无统计学意义 (P＞0.05，见表1)。

2.2 实验室检查结果 皮下注射G－CSF之前 (第1天)，两组胞数、WBC、PLT、肝肾功能、凝血功能指标间差异均无统计学意义 (P＞0.05，见表2)。

2.3 NIHSS评分和Barthel指数评分分级比较 第1天和入组1个月两组NIHSS评分间差异无统计学意义 (P＞0.05)，入组2、3个月两组间差异有统计学意义 (P＜0.05，见表4)。两组不同时间点Barthel指数评分分级间差异均无统计学意义(P＞0.05，见表5)。

2.4 不良事件 G－CSF组发生胃肠道反应19例 (47.5%)，包括恶心、呕吐、胃痛和厌食;骨骼肌肉疼痛15例(37.5%)和发热12例 (30.0%)，疼痛均为轻中度，没有因此而停药，发热体温最高者为38.6℃，只应用酚氨加敏退热处理;1例患者在住院第26天时发生左腋静脉堵塞导致左上肢肿胀，用尿激酶溶栓后好转，后又发生急性心肌梗死，转心内科治疗，预后良好。对照组未发生血栓性栓塞事件。

表4 两组不同时间点NIHSS评分比较 (±s，分)Table 4 Comparison of NIHSS scores between two groups in different times

表4 两组不同时间点NIHSS评分比较 (±s，分)Table 4 Comparison of NIHSS scores between two groups in different times

组别 例数 第1天 入组1个月入组2个月入组3个月对照组42 11.0±2.6 9.1±1.8 7.5±0.9 6.5±0.8 G－CSF组 40 11.4±2.5 8.5±1.7 6.4±1.0 5.5±0.6 t 值0.49 －0.99 －2.91 －4.12 P值0.63 0.33 0.01 0.00

表1 两组患者的基线资料比较Table 1 Comparison of baseline characteristics between two groups

表2 两组第1天实验室检查指标比较 (±s)Table 2 Comparison of laboratory results between two groups in first day

表2 两组第1天实验室检查指标比较 (±s)Table 2 Comparison of laboratory results between two groups in first day

注:WBC=白细胞计数，PLT=血小板计数，ALT=丙氨酸氨基转移酶，Scr=血肌酐，APTT=活化部分凝血活酶时间，PT=凝血酶原时间，Fib=纤维蛋白原

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表3 试验组第1～8天实验室检查指标比较 (±s)Table 3 Comparison of the laboratory indexes in G－CSF group from the first day to the eighth day

表3 试验组第1～8天实验室检查指标比较 (±s)Table 3 Comparison of the laboratory indexes in G－CSF group from the first day to the eighth day

注:与其他时间点比较，*P＜0.05;与第6天比较，△P＜0.05

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表5 两组不同时间点Barthel指数评分分级比较〔n(%)〕Table 5 Comparison of Barthel Index score grade between two groups in different times

3 讨论

脑梗死发病后48 h就可以在梗死区及其周边的神经元检测到G－CSF受体［5］，Dunac等［6］发现脑梗死患者外周血细胞数明显升高，而且升高幅度越大的患者预后越好。由此推测G－CSF可能是通过动员细胞起神经保护作用的，并开展了G－CSF治疗脑梗死的临床试验。Schabitz等［7］入组了44例发病12 h内的脑梗死患者，G－CSF持续72 h静脉给药，总体上没有观察到治疗组和对照组临床结局的差异，但亚组分析显示梗死体积＞14～17 ml者应用G－CSF能改善预后，而且G－CSF剂量越大，获益越多。据此，本研究选择了梗死体积＞15 ml的大脑中动脉区梗死患者82例，随机分为G－CSF组(40例)和对照组 (42例)，结果发现G－CSF组NIHSS评分下降明显，两组在入组2个月时差异有统计学意义，与Shyu等［8］结果类似。

从Barthel指数评分分级层面分析，两组间未发现统计学差异，神经功能层面和Barthel指数评分分级结果的不一致说明有些患者虽然神经功能改善，但没有达到能改善日常生活能力的程度。入组3个月时，G－CSF组极重度残疾患者所占的比例下降明显，提示G－CSF可能对病情严重的患者更有优势，与Schabitz等［7］的结果相似 (脑梗死面积较大的患者应用G－CSF疗效较明显)。国内几项临床试验表明，应用G－CSF不仅能减轻神经功能缺损程度，而且对日常生活能力也有明显改善，但没有进一步分析G－CSF对哪些患者更有效，特别是没有对脑梗死的体积进一步行亚组分析［9－11］。Sprigg 等［12］则认为皮下注射G－CSF并不能改善脑梗死患者3个月的结局，但其入组的是卒中发病后7～28 d的患者，本研究为发病7 d内的患者。

实验室检查指标方面，本研究重点观察了外周血细胞数的变化。CD34分子是一种跨膜糖蛋白，选择性地表达于造血干/祖细胞表面，并随细胞的成熟逐渐减弱至消失。本研究显示细胞数随着G－CSF应用时间的增加而升高，停用G－CSF后迅速下降，说明G－CSF确实能动员骨髓造血干细胞进入外周血从而进入大脑，但能否透过血－脑脊液屏障进而分化为成熟的神经细胞尚待检验。Sprigg等［12］也观察到类似结果，而且证实G－CSF剂量越大、应用次数越多外周血细胞数越多，最大剂量组 (10 μg/kg，皮下注射，1次/d，×5 d)细胞数峰值为37.7个/μl，高于本试验22.4个/μl的峰值。值得注意的是，本研究观察到G－CSF组D－二聚体明显升高，而且停用G－CSF后至少3 d内仍在升高，说明体内存在频繁的血栓形成和溶解过程，提示G－CSF组血栓栓塞事件可能多于对照组，观察显示大部分患者并没有出现临床症状和体征，分析原因可能是由于WBC升高增加了血液黏稠度导致血液容易凝固，从而导致了继发性纤溶亢进，目前国内外尚没有类似报道。与Schabitz等［7］研究结果一致，本研究也观察到了ALT有升高趋势，PLT有一定程度的下降，但均在参考范围内，临床没有观察到出血事件的增加。

Floel等［13］的研究是目前发表的惟一针对慢性脑梗死的临床试验，对发病4个月后的慢性脑梗死患者皮下注射G－CSF，重点观察安全性和有效性。结果发现G－CSF组不良事件发生率高于对照组，但均为轻中度的且均是G－CSF说明书上提及的不良反应，本研究结果与其一致。不同的是本研究G－CSF组有1例患者反复发生静脉性和动脉性血栓栓塞事件，不能确定是否与应用G－CSF导致WBC升高有关。虽然几乎所有试验报道了G－CSF不增加血栓栓塞事件，但本研究发现G－CSF组D－二聚体水平逐渐升高，提示机体内存在较活跃的反复的血栓形成和溶解过程，这一点仍然值得重视。

总之，发病7 d内且梗死体积＞15 ml的缺血性脑卒中患者皮下注射G－CSF(300 μg/次，2次/d)能改善预后，但可能增加血栓栓塞事件的风险。其机制可能是通过动员骨髓造血干/祖细胞进入外周血从而促进新生血管的形成、抗神经细胞凋亡和促进新神经元的发生。

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4 Gibson CL，Bath PM，Murphy SP.G－CSF reduces infarct volume and improves functional outcome after transient focal cerebral ischemia in mice［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2005，25(4):431－ 439.

5 Hasselblatt M，Jeibmann A，Riesmeier B，et al.Granulocyte－colony stimulating factor(G－CSF)and G－CSF receptor expression in human ischemic stroke［J］.Acta Neuropathol，2007，113(1):45 －51.

6 Dunac A，Frelin C，Popolo－Blondeau M，et al.Neurological and functional recovery in human stroke are associated with peripheral bloodcell mobilization［J］.J Neurol，2007，254(3):327 －332.

7 Schabitz WR，Laage R，Vogt G，et al.AXIS:a trial of intravenous granulocyte colony －stimulating factor in acute ischemic stroke［J］.Stroke，2010，41(11):2545 －2551.

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12 Sprigg N，Bath PM，Zhao L.Granulocyte－colony－stimulating factor mobilizes bone marrow stem cells in patients with subacute ischemic stroke:the Stem cell Trial of recovery Enhancement after Stroke(STEMS)pilot randomized，controlled trial［J］.Stroke，2006，37(12):2979 －2983.

13 Floel A，Warnecke T，Duning T，et al.Granulocyte－ colony stimulating factor(G－CSF)in stroke patients with concomitant vascular disease——a randomized controlled trial［J］.PLoS One，2011，6(5):e19767－e19776.