王凌，孙利芹，周妍

（烟台大学生命科学学院，山东烟台 264005）

小球藻（Chlorellasp.）是一类普生性单细胞绿藻，含有丰富的蛋白质、多糖、脂质、叶绿素、维生素、微量元素和一些生物活性代谢产物，有“药物藻类”之美誉[1]。有研究表明，小球藻干粉或其提取物能使免疫低下小鼠的细胞免疫功能有所恢复[2-4]。Tanaka等报道[3]小球藻提取物在小鼠抗肿瘤MethA的作用中，需要抑制性T淋巴细胞的参与，即通过淋巴器官中T细胞的活化，并增强肿瘤部位T细胞的补充来抑制肿瘤转移。Hasegawa等[5]研究给予白血病小鼠小球藻后，可恢复其对单核增生李斯特氏菌的清除力，感染部位的T细胞数目增加。

多糖是小球藻提取液中主要的活性成分之一，在抗肿瘤、抗病源菌、抗病毒方面具有显著效果[6]。施瑛、盛建春等[7-8]针对蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）多糖进行了体外抗肿瘤和免疫功能的研究，而关于普生小球藻多糖对正常小鼠细胞免疫系统影响的报道较少。以普生小球藻为研究对象，以其多糖对小鼠脾脏淋巴细胞增殖，腹腔巨噬细胞增殖、吞噬中性红及释放NO能力的影响为指标，详细考察了小球藻多糖对健康小鼠细胞免疫系统的影响，以期为小球藻及其多糖作为功能食品基料的开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 样品

小球藻多糖由小球藻藻泥经细胞破碎，热水提取，Sevag法去蛋白，乙醇沉淀，透析，冷冻干燥得到多糖干粉。精密称取多糖干粉4 mg，溶于20 mL的RPMI1640培养基中，得浓度为200 μg/mL的多糖溶液，用直径为0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌备用。使用时依次倍比稀释可得浓度为 100，50，25，12.5 μg/mL的溶液。

1.2 试剂及仪器

刀豆蛋白 A（ConA）、脂多糖（LPS）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、四甲基偶氮唑盐（MTT）、十二烷基磺酸钠（SDS） 均为 Sigma公司；RPMI－1640 培养基：Gibco公司；新生小牛血清：杭州四季青生物工程材料有限公司；Synergy HT型酶联免疫检测仪：美国Bio－TEK公司。

1.3 实验动物及细胞株

清洁级昆明种小鼠，雌雄不限，体重18 g～22 g，山东绿叶制药有限公司（许可证号：SYXK（鲁）20030020）。小鼠巨噬细胞样细胞株RAW264.7（ATCC TIB－71），上海细胞研究所提供。

1.4 实验方法

1.4.1 小鼠单核腹腔巨噬细胞Raw264.7吞噬中性红实验

取处于对数生长期的小鼠单核－巨噬细胞RAW264.7，胰酶消化收集细胞，用含10%胎牛血清的RPMI－1640培养液调整细胞浓度为1×106/mL，加入96 孔板，100 μL/孔，置 37 ℃、5%CO2培养 2 h，弃上清，磷酸盐缓冲液洗3次，洗去未贴壁的细胞，补充新鲜培养液，加入用培养液稀释的不同浓度的小球藻多糖 100 μL/孔，并以 100 μL LPS（2 μg/mL）、培养液作阳性和阴性对照；培养24 h后弃上清，每孔加入0.08%中性红溶液100 μL，继续培养20 min后，倾上清，PBS洗3遍，每孔加入细胞溶解液0.2 mL，室温下静置过夜，待细胞溶解后，即在酶联免疫检测仪上测540 nm处的吸光度。

1.4.2 小鼠单核腹腔巨噬细胞Raw264.7释放NO能力的检测

参照1.4.1制备巨噬细胞悬液，调整细胞浓度为2.5×105/mL，于 96 孔板接种 100 μL/孔，置 37 ℃，5%CO2培养24 h。加药同上。继续培养48 h后，从每个孔取50 μL培养上清液到一个新的96孔板中，加入等量的Griess试剂，室温反应10 min，30 min之内在520 nm～550 nm之间（540 nm）测定吸光度。根据标准曲线计算NO的含量。实验重复3次。

1.4.3 小鼠单核腹腔巨噬细胞Raw264.7增殖能力的测定

参照1.4.1，加药培养24 h后，SRB法检测[8]。

1.4.4 小鼠脾淋巴细胞增殖实验

无菌取脾，制备小鼠脾淋巴细胞悬液，调整细胞浓度为 8×106个/mL～10×106个/mL。按照 1.4.1 加药，阳性对照为ConA 100 μL/孔（10μg/mL），置 5%CO2，37 ℃培养48 h。培养结束前4 h，MTT法检测[9]。

1.4.5 数据处理

所有数据均以均值±标准差表示。t检验采用SPSS11.5统计软件包完成，以P＜0.05表示差异显著；P＜0.01表示差异极其显著。

2 结果与讨论

2.1 小球藻多糖对小鼠巨噬细胞吞噬中性红能力的影响

巨噬细胞作为机体免疫系统的重要组成成分，在体液免疫和细胞免疫中发挥中心作用。它可以直接吞噬外来异物及衰老的自身细胞，还可分泌白介素等细胞因子，进而发挥抗病毒、抗肿瘤作用[10]。表1数据显示，小球藻多糖在12.5μg/mL～200μg/mL

表1 小球藻多糖对小鼠巨噬细胞吞噬中性红活性的影响（±s，n=9）Table 1 Effect of Chlorella polysaccharides on neutral red uptake of mouse macrophage（±s，n=9）

表1 小球藻多糖对小鼠巨噬细胞吞噬中性红活性的影响（±s，n=9）Table 1 Effect of Chlorella polysaccharides on neutral red uptake of mouse macrophage（±s，n=9）

注：与对照组相比，*P＜0.05；**P＜0.01。

实验组给药剂量/（μg/mL）吸光度OD540空白对照组 － 0.756±0.007脂多糖（LPS） 2 1.168±0.013**200 1.155±0.021**100 1.178±0.009**50 1.406±0.074**25 1.032±0.039*12.5 1.095±0.009**小球藻多糖

浓度范围内，均可显著或极显著促进巨噬细胞吞噬中性红的作用（P＜0.05或 P＜0.01），浓度为 50 μg/mL 时，对巨噬细胞吞噬功能的增强作用最强，比空白对照组高出1.86倍，是阳性对照组（LPS）的1.2倍，随后促进作用有所下降。一般认为，巨噬细胞的代谢状况和其吞噬能力直接相关，代谢旺盛，则说明巨噬细胞的吞噬能力增强；代谢减弱，则吞噬功能下降。因此本实验数据表明小球藻多糖能够促进机体巨噬细胞的代谢能力。

2.2 小球藻多糖对小鼠腹腔巨噬细胞产生NO的影响

在免疫细胞中NO是由诱导型NO合酶催化生成的，正常情况下，哺乳动物体内可连续产生少量NO，细胞因子刺激免疫细胞可产生大量NO。NO在免疫系统中作为信号转导的一种重要介质而起作用[10]。不同浓度小球藻多糖对腹腔巨噬细胞产生NO的影响如表2 所示。可以看出，在 12.5 μg/mL～200 μg/mL 的浓度范围内，小球藻多糖可明显地促进小鼠腹腔巨噬细胞产生NO，并呈一定的剂量的依赖性，随着浓度的升高，诱生NO的能力增强，在浓度为100 μg/mL时，其NO浓度是空白对照组的1.96倍。但是与阳性对照组脂多糖相比，促进作用稍弱。表明小球藻多糖可通过诱导和激活腹腔巨噬细胞来产生NO，从而达到增强细胞免疫能力的目的。

表2 小球藻多糖对小鼠腹腔巨噬细胞产生NO的影响（±s，n=9）Table 2 Effect of Chlorella polysaccharides on NO production（±s，n=9）

表2 小球藻多糖对小鼠腹腔巨噬细胞产生NO的影响（±s，n=9）Table 2 Effect of Chlorella polysaccharides on NO production（±s，n=9）

注：与对照组相比，*P＜0.05；**P＜0.01。

实验组给药剂量/（μg/mL）NO浓度/（μmol/mL）空白对照组 － 3.598±0.509脂多糖（LPS） 2 8.905±0.385**200 7.408±0.763**100 7.068±1.503**50 6.728±0.385**25 6.116±0.976**12.5 4.823±0.787*小球藻多糖

2.3 小球藻多糖对小鼠腹腔巨噬细胞增殖的影响

小球藻多糖对小鼠腹腔巨噬细胞增殖的影响见图1。

图1 小球藻多糖对小鼠腹腔巨噬细胞增殖的影响Fig.1 Effect of Chlorella polysaccharides on the proliferation of mouse peritoneal macrophage（±s，n=9）

在 12.5 μg/mL～100 μg/mL 的浓度范围内，小球藻多糖可显著地促进小鼠腹腔巨噬细胞增殖，与对照组相比有极显著差异（P＜0.01）。在 50 μg/mL 时，促进作用最强。随后随浓度继续增加，促进作用减弱，至200 μg/mL时，与空白对照组相比，无显著性差异（P＞0.05）LPS在2 μg/mL浓度下可极显著促进小鼠腹腔巨噬细胞的增殖（P＜0.01）。这一结果与2.1中小球藻多糖对巨噬细胞吞噬中性红能力影响结果一致，进一步证明了巨噬细胞代谢功能与吞噬能力这一关系。

2.4 小球藻多糖对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响

脾脏是机体内重要的免疫器官，富含T、B淋巴细胞，加之其易于分离，是体外试验中淋巴细胞的重要来源。测定淋巴细胞体外增殖反应是检测淋巴细胞功能的常用方法[10－11]。本研究中图2数据显示，低浓度（12.5 μg/mL）的小球藻多糖与空白对照组相比，无显著性差异（P＞0.05），在 25 μg/mL～200 μg/mL 的浓度范围内，小球藻多糖可极显著地刺激并促进脾淋巴细胞的增殖（P＜0.01），且随多糖浓度提高，刺激作用不断增强，表明小球藻多糖对脾淋巴细胞增殖活性呈现明显的剂量依赖性。

图2 小球藻多糖对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响Fig.2 Effect of Chlorella polysaccharides on the spleen lymphopoiesis of mouse（±s，n=9）

3 结论

小球藻多糖在 12.5 μg/mL～200 μg/mL 浓度范围内，对巨噬细胞吞噬中性红有明显的促进作用，并可显著地促进小鼠腹腔巨噬细胞增殖，二者都在50μg/mL时促进作用达最大值；实验浓度范围内，小球藻多糖可明显地促进小鼠腹腔巨噬细胞产生NO，并呈一定的剂量的依赖性，在浓度为100 μg/mL时，其NO浓度是空白对照组的1.96倍，但是与阳性对照组脂多糖相比，促进作用稍弱；在 25 μg/mL～200 μg/mL 的浓度范围内，小球藻多糖可极显著地刺激并促进脾淋巴细胞的增殖（P＜0.01），且随多糖浓度提高，作用增强，表明小球藻多糖对脾淋巴细胞增殖活性呈现明显的剂量依赖性。本次研究结果显示小球藻多糖在机体免疫调节等方面可能有重要作用和良好的应用前景。

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