韩俊华，李珊珊，裴家伟，陈大欢，张柏林

（1.河北科技大学生物科学与工程学院，河北石家庄050018；2.北京林业大学生物科学与技术学院，北京100083；3.河北农业大学食品科技学院，河北保定071001）

益生菌广泛应用于保健食品、药品、乳制品、饲料等各个行业，与人们的日常生活关系越来越密切。FAO/WHO在《用于食品的益生菌安全性评价指导原则》中指出，未经评估的益生菌可能会存在一些潜在的安全性问题，其中，长期使用的益生菌所携带耐药基因的转移是人们所担忧的[1]。目前，抗生素滥用已成为一个严重的社会问题，由此引发的细菌耐药性问题也日趋严峻。尽管传统的益生菌菌种已有很长的安全使用历史，如德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgricus），然而伴随着新菌种的不断开发和进入市场，其潜在的安全性问题也逐渐引起人们的重视。近十年来，有关乳酸菌、双歧杆菌等益生菌的耐药性方面已经开展了一定的研究工作。研究发现，大部分乳酸菌对抗革兰阴性菌的抗菌药具有耐药性，例如链霉素、庆大霉素和卡那霉素，其中部分乳杆菌对万古霉素、卡那霉素、多黏菌素B等表现出抗药性[2-4]。D’aimmo等报道了双歧杆菌、乳杆菌、片球菌等对卡那霉素、萘啶酮酸、多粘菌素B等的抗性以及与抗性有关的基因，如长双歧（Bifidobacterium longum）抗四环素的基因tet（W），干酪乳杆菌（L.casei）抗四环素和红霉素的质粒基因tet（M）和erm（B）等[5]。Toomey等和ANA等则进一步报道了抗四环素基因tet（M）在菌株间的转移现象[6-8]。显然，这种抗药基因在菌种间的转移会对人类的健康产生影响。食品是益生菌的主要载体，益生菌的安全性势必影响到其食品的安全，因此其耐药性以及抗生素抗性是否可转移就会引起人们的重视。本研究对前期筛选到的几株能够耐受胃酸、胆盐和蛋白酶的乳杆菌的耐药性进行了研究，通过质粒消除探讨了耐药性与质粒的相关性，对进一步确定耐药性的转移提供了理论基础，旨在为潜在益生乳杆菌的安全性评价及其评价方法的建立提供理论和技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

5株耐受胃酸、胆盐和蛋白酶且含有质粒的乳杆菌 其菌种编号、名称及来源见表1，该菌种均由中国工业微生物菌种保藏中心（CICC）收藏；抗生素敏感性实验的质控菌株 采用CLSI（Clinical and Laboratory Standards Institute，临床实验室标准化研究所，简称CLSI，以前称NCCLS）推荐的大肠杆菌ATCC25922，购自中国科学院微生物研究所；乳杆菌采用MRS培养基，37℃培养；大肠杆菌ATCC25922采用LB培养基，30℃培养；氨苄西林10μg/片、杆菌肽0.04U/片、青霉素G 10U/片、多粘菌素B 300μg/片、利福平5μg/片、头孢噻吩30μg/片、链霉素10μg/片、卡那霉素30μg/片、四环素30μg/片、氯霉素30μg/片、庆大霉素10μg/片、萘啶酸30μg/片、万古霉素 30μg/片（直径6mm）均购自中国药品生物制品检定所，符合CLSI标准；SDS、EB、氯霉素、氨苄青霉素 美国Sigma公司；质粒提取试剂盒、PCR Mix、100bp Ladder Marker 北京天根试剂公司；λHindⅢ Marker、HB101 上海宝生物公司；溶菌酶 Biotech公司。

表1 实验菌株Table 1 Strains for experiment

GL-20G-II型冷冻离心机、TGL-16G型台式离心机 上海安亭科学仪器厂；XSZ-G型光电显微镜 重庆光学仪器厂；SPX-150B型生化培养箱 上海博讯实业有限公司；BTS-20M型凝胶成像系统、TGradient Thermocycler 96型PCR仪 德国Biometra公司。

1.2 实验方法

1.2.1 K-B法检测乳杆菌的耐药性 参考管远志等[9]的方法。待测菌在MRS培养基（蛋白胨10.0g/L，牛肉膏10.0g/L，酵母膏5.0g/L，柠檬酸氢二铵2.0g/L，葡萄糖20.0g/L，吐温80 1.0mL/L，乙酸钠5.0g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，硫酸镁0.58g/L，硫酸锰0.25g/L，pH6.2±0.2）中，37℃培养16h后，以无菌生理盐水稀释至0.5麦氏标准浊度（菌体浓度约为5×108CFU/mL）。取该菌液1mL入灭菌平皿中，将融化的MH固体培养基（牛肉膏6.25g/L；酪蛋白胨17.5g/L；可溶性淀粉1.5g/L；琼脂1.3%；pH7.2±0.2，）约20mL倒入平皿，混匀。待培养基凝固后，室温放置3～5min，用镊子将药敏纸片贴放在平皿上，轻压使紧贴琼脂表面，静置5min，置于37℃培养箱内，恒温培养16～18h。量取抑菌圈直径，并记录结果。以标准敏感菌株大肠杆菌ATCC25922为质控菌，操作同上。受试菌株对多种抗生素的敏感性参照国际现行的临床实验室标准化协会CLSI制定的《抗菌药物敏感性实验执行标准》第十九版信息增刊提供的纸片法标准进行判定（见表2）[10]。报告该受试菌对该抗生素是敏感（susceptible，S）、耐药（resistant，R）、还是中介（intermediate，I）。

表2 K-B法药敏实验纸片含药量和判断标准Table 2 Antibiotic susceptibility testing paper concentration and interpretation standards of K-B method

1.2.2 质粒提取及检测 取培养过夜的菌液10mL于离心管中，10000r/min离心5min，弃去上清，向沉淀中加入10mg/mL溶菌酶（以pH8.0，10mmol/L的Tris-HCl配制）500μL，摇匀，37℃水浴45min。采用质粒提取试剂盒，对待测菌株质粒进行提取，并进行1%的琼脂糖凝胶电泳，以λHindⅢ为标准分子量Marker。

1.2.3 质粒消除

1.2.3.1 SDS法 将待测菌株以2%的接种量接至含有不同浓度SDS的灭菌MRS培养基中（SDS浓度分别为0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%）[11]，37℃恒温培养12代，每代24h，以质粒消除前菌株为对照，分别进行质粒提取，并对消除后的菌株进行抗生素敏感性检测。

表3 抗性基因的引物序列Table 3 The primer sequences of resistance genes

1.2.3.2 SDS-高温法 将待测菌株以2%的接种量接至含有不同浓度SDS的灭菌MRS培养基中（SDS浓度分别为0.01%、0.015%、0.02%、0.025%、0.03%），37℃恒温培养24h，再以2%的接种量转入灭菌MRS培养基中，42℃恒温培养24h，此为一个循环[12]，重复2～3次，以质粒消除前菌株为对照，分别进行质粒提取，并对消除后的菌株进行抗生素敏感性检测。

1.2.4 抗性基因的检测 在NCBI中查到质粒上的β-内酰胺类抗性基因blr、ECP-1569、nps-1，以及氯霉素抗性基因cmlA、cat、cmlA1，在Genbank中下载其全序列，设计引物，序列见表3，委托三博远志公司合成。

以待测菌株的质粒DNA为模板，进行PCR反应。反应程序为：94℃预变性4min，94℃变性30s，相应温度退火30s，72℃延伸1min，34次循环，72℃延伸10min。反应产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳（80～120V，30min），观察产物电泳带及其位置，按照100bp Ladder Marker确定扩增产物的大小。委托宝生物工程（大连）有限公司对PCR产物进行回收、测序。

2 结果与分析

2.1 待测菌株的抗生素敏感性

采用K-B药敏纸片法检测5株乳杆菌对13种抗生素的敏感性，记录抗生素对供试菌株的抑菌圈直径，结果见表4。

按照CLSI制定的《抗菌药物敏感性实验执行标准》提供的纸片法标准进行判定，结果如表5所示。据表5可知，待测的5株乳杆菌对万古霉素、多粘菌素B、杆菌肽、链霉素、卡那霉素、庆大霉素以及萘啶酸具有普遍的抗性，耐药率达100%，而主要对四环素敏感，其中，嗜酸乳杆菌LL对11种抗生素（除青霉素G、利福平外）表现出较普遍的抗性。

2.2 抗性菌株的质粒提取

表4 抗生素对待测菌株的抑菌圈直径（mm）Table 4 Inhibition zone diameter of antibiotics to the tested strains（mm）

注：表中抑菌圈直径为7，则表示纸片周围没有出现透明圈。

表5 待测乳杆菌对13种抗生素的敏感性Table 5 Antibiotic susceptibility of 13 antibiotics to the tested Lactobacillus strains

采用质粒提取试剂盒对待测乳杆菌的质粒进行提取，结果如图1所示。

图1 乳杆菌中的质粒Fig.1 Plasmid in Lactobacillus strains

由图1可见，戊糖乳杆菌CH8的电泳图显示有6条质粒DNA条带，其中一条大于23kb。戊糖乳杆菌Lp-A显示有两条质粒DNA条带，分别为10kb、5kb左右。嗜酸乳杆菌LL和植物乳杆菌L11分别显示有2条和4条质粒DNA条带，均含有一条10kb左右的质粒条带。瑞士乳杆菌LLB的电泳图仅显示一条10kb左右的质粒DNA条带。乳酸菌中普遍存在着质粒，至少25种乳杆菌具有固有质粒，而且一种菌有多个质粒，质粒大小一般在1.9～84.8kb，绝大多数的质粒小于20kb[13]。Gevers等（2003）对风干香肠中的乳杆菌进行检测，发现这些乳杆菌均具有10kb左右的质粒，且在这些质粒上携带了四环素耐药基因tetM[14]。

在细菌的传代过程中，某些质粒可能会从细胞中消失，但大多数的质粒是稳定存在的。本研究也对传代30代后上述乳杆菌菌株的质粒进行了检测，结果证明了其质粒的稳定性。

2.3 质粒消除

耐药质粒的存在是细菌耐药性的一个主要原因，因此质粒消除是耐药性消除的一种重要方法。质粒消除便于观察比较消除前后菌体表型的变化，从而得出质粒的遗传功能，在对于质粒所含基因的研究中具有重要意义。

2.3.1 SDS法消除质粒

2.3.1.1 消除前后的质粒变化 采用浓度为0.05%～0.25%的SDS分别处理供试菌株，在SDS浓度为0.15%、0.2%和0.25%时，上述菌株均不能存活；浓度为0.1%时戊糖乳杆菌Lp-A和植物乳杆菌L11不能存活。因此选择SDS处理后存活的菌株进行质粒检测，结果如图2～图6所示。

结果表明，SDS浓度为0.05%时，植物乳杆菌L11的四条质粒（在1～10kb不等）被完全消除（见图4，泳道2），戊糖乳杆菌CH8的质粒没有被消除。当SDS浓度增加到0.1%时，戊糖乳杆菌CH8的6条质粒丢失了5条，包括一条大于23kb的质粒及2kb到10kb间大小不等的4条质粒，一条15kb左右的质粒没有被消除（见图2，泳道3）。而嗜酸乳杆菌LL（见图3）、戊糖乳杆菌Lp-A（见图6）和瑞士乳杆菌LLB（见图5）的质粒均未被消除。由此可见，用SDS消除乳杆菌质粒的效果不显著，与之前的相关报道不相符[15]。

图2 SDS法消除戊糖乳杆菌CH8质粒Fig.2 Plasmid eliminate results of L.pentosus CH8 by SDS method

图3 SDS法消除嗜酸乳杆菌LL质粒Fig.3 Plasmid eliminate results of L.acidophilus LL by SDS method

图4 SDS法消除植物乳杆菌L11质粒Fig.4 Plasmid eliminate results of L.plantarum L11 by SDS method

图5 SDS法消除瑞士乳杆菌LLB质粒Fig.5 Plasmid eliminate results of L.helveticus LLB by SDS method

图6 SDS法消除戊糖乳杆菌Lp-A质粒Fig.6 Plasmid eliminate results of L.pentosus Lp-A by SDS method

2.3.1.2 消除质粒后菌株抗生素敏感性的变化 采用K-B药敏纸片法检测质粒消除后的CH8和L11菌株对抗生素的敏感性，结果见表6。由表6可知，戊糖乳杆菌CH8质粒消除前后，其抗生素敏感性发生了部分变化。质粒消除前，CH8菌株对氯霉素和头孢噻吩均表现出抗性，而消除后对这两种抗生素均表现出敏感，对其他11种抗生素的敏感性没有变化。可见，消除的质粒上可能含有抗氯霉素和头孢噻吩的抗性基因。而植物乳杆菌L11消除了全部质粒后，与消除前相比，其抗生素敏感性没有变化，这也初步表明，植物乳杆菌L11的质粒上不含有所试抗生素的抗性基因，或者在质粒和基因组上同时含有所试抗生素的抗性基因。

2.3.2 SDS-高温法消除质粒

2.3.2.1 消除前后的质粒变化 采用浓度0.01%～0.03%的SDS分别处理供试菌株，并进行高温培养。在SDS浓度为0.01%、0.015%和0.02%时，上述乳杆菌均存活，但只有CH8的质粒被部分消除，且消除效果并不随浓度的增加而改变，浓度为0.025%、0.03%时，CH8和部分菌株不能存活，仍具有存活能力的菌株，其消除效果不随SDS浓度的增加而改善。因此选择SDS-高温处理后存活菌株进行质粒检测，结果如图7～图11所示。

结果表明，嗜酸乳杆菌LL（见图8）、戊糖乳杆菌Lp-A（见图9）、瑞士乳杆菌LLB（见图10）和植物乳杆菌L11（见图11）在SDS-高温处理后质粒并没有被消除，而戊糖乳杆菌CH8的6条质粒中丢失了5条（见图7，泳道1、2、3），被部分消除。

图7 SDS-高温法对消除戊糖乳杆菌CH8质粒Fig.7 Plasmid eliminate results of L.pentosus CH8 by SDS-high temperature method

图8 SDS-高温法消除嗜酸乳杆菌LL质粒Fig.8 Plasmid eliminate results of L.acidophilus LL by SDS-high temperature method

图9 SDS-高温法消除戊糖乳杆菌Lp-A质粒Fig.9 Plasmid eliminate results of L.pentosus Lp-A by SDS-high temperature method

表6 质粒消除后抗生素敏感性的变化Table 6 Antibiotic sensitivity of the tested strains after eliminated the plasmids

图10 SDS-高温法消除瑞士乳杆菌LLB质粒Fig.10 Plasmid eliminate results of L.helveticus LLB by SDS-high temperature method

图11 SDS-高温法消除植物乳杆菌L11质粒Fig.11 Plasmid eliminate results of L.plantarum L11 by SDS-high temperature method

2.3.2.2 消除质粒后菌株抗生素敏感性的变化 采用K-B药敏纸片法检测质粒消除后戊糖乳杆菌CH8对13种抗生素的敏感性，结果见表7。由表7可见，CH8菌株进行质粒消除后其抗生素敏感性发生了部分变化。质粒消除前，CH8菌株对氯霉素和头孢噻吩均表现出抗性，而质粒消除后菌株对这两种抗生素均表现出敏感，对其他11种抗生素的敏感性没有变化。该结果表明，消除的质粒上可能存在抗氯霉素和头孢噻吩的抗性基因。

2.4 抗性基因的检测

以戊糖乳杆菌CH8的质粒为模板，以表3中相应的序列为引物，进行PCR反应，结果如图12所示。

由图12可见，戊糖乳杆菌CH8的质粒上存在β-内酰胺类抗性基因blr，不含有其他抗性基因。对上述目的条带进行回收、测序，并经DNAman aligment分析发现，该序列与目的序列仅在第43和64位点有两个碱基的差异，很可能是由于菌株差异造成的。因此可以初步确定戊糖乳杆菌CH8的质粒上含有blr基因，且该基因是决定其头孢噻吩抗性的基因。将该戊糖乳杆菌CH8菌株的质粒转化大肠杆菌也进一步证实了这一点。然而，要确定blr基因位于CH8菌株的哪些质粒上还有待于进一步研究。

图12 戊糖乳杆菌CH8质粒的PCR结果Fig.12 PCR result of L.pentosus CH8 plasmid

国内外常用的药敏检测方法都是通过细菌的表型来判断其耐药性，且对于抗性基因的研究多集中于致病菌。如果能在菌株抗生素抗性的表型与基因型之间建立联系，就可能对该表型对应的基因进行定位，从而从分子水平对细菌的耐药性进行深入分析。

目前，我国还少见由益生菌感染动物及人体的报道，也缺乏对其耐药性及使用后的流行病学调查资料，对益生菌的安全性评价手段与国际水平还处在一定的差距。随着越来越多的新菌种申报进入国内市场以，也附带了不安全性的风险。因此，本研究方法可以为乳制品市场常用益生菌菌种的安全性进行风险评估，为建立适合国情的益生菌安全性评价体系提供技术依据。

3 结论

3.1 以大肠杆菌ATCC25922为质控菌株，对5株潜在益生乳杆菌的抗生素敏感性研究表明，菌株均对万古霉素、多粘菌素B、杆菌肽、链霉素、卡那霉素、庆大霉素以及萘啶酸表现出普遍的抗性，耐药率达100%。

3.2 无论采用SDS还是SDS-高温法消除质粒方法，仅对部分菌株中的某些质粒有效，即不同菌株之间，对于不同的质粒其消除方法的有效性存在着差异。

3.3 对消除质粒后的戊糖乳杆菌CH8抗生素敏感性的分析表明，CH8菌株的质粒上存在决定其头孢噻吩抗性的基因blr，这在一定程度上反映出益生乳杆菌质粒抗生素抗性基因与其耐药性间存在相关性。

表7 戊糖乳杆菌CH8质粒消除后抗生素敏感性的变化Table 7 Antibiotic sensitivity of L.pentosus CH8 after eliminated the plasmids

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