宁 旭，杨德猛，王长庚，李江伟，叶 川，任世超

(1 贵阳医学院附属医院，贵阳 550004;2 江西省萍乡市人民医院)

结核杆菌(MTB)是对人类健康威胁最大的病原体之一。骨关节结核是由MTB通过血液或淋巴系统播散至骨与关节，造成血供丰富和负重大或活动较多的骨关节发生坏死，是发病率最高的肺外结核疾病，占肺外结核总发病率的35%［1］。研究表明，TNF-α能通过与破骨细胞前体细胞上的相应受体结合，直接或间接调节破骨细胞的分化、激活和凋亡［2-4］。但在骨关节结核发病过程中TNF-α是否调控破骨细胞分化、激活，导致骨破坏鲜见报道。2011年7月～2012年9月，我们进行了相关研究。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 3周龄雄性昆明小鼠6只，由第三军医大学实验动物中心提供;标准MTB(mycobacterium tuberculosis H37rv)由贵阳医学院微生物教研室提供。主要实验材料有α-MEM培养基(Gibico)，抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色试剂盒(Sigma)，胎牛血清(南美Hyclone)，小鼠TNF-α试剂盒(ADL)。

1.2 方法

1.2.1 MTB冻干物的制备 取对数期MTB，加入无菌水，制成混悬液。超声裂解组取MTB混悬液，冰浴条件下超声裂解仪裂解，设置电压300 W，超声时间8 s，超声间隔10 s，裂解30 min，所得混悬液低温离心50 min，取上清液，0.45 μm 滤过膜过滤、分装、冻干，4℃保存备用。热处理组取MTB混悬液，80℃密封水浴30 min×2次，所得混悬液分装、冻干，4℃保存备用。

1.2.2 小牛骨磨片的制备 取新鲜小牛四肢皮质骨，手工修成0.5 cm×0.5 cm 大小骨块并打磨光滑，在5%戊二醛固定2 h后，用Leica硬组织切片机将骨块切成10 μm厚骨片，依次行梯度乙醇脱水、0.25 mol/L稀氨水超声清洗仪清洗3次，自然干燥后用铅笔标记正反面，经γ射线照射消毒后，浸泡在含链霉素和青霉素各1000 U/mL的PBS液中，4℃保存备用。

1.2.3 小鼠破骨细胞的诱导与分组 将6只小鼠用脱髓法处死，75%乙醇浸泡5 min，无菌操作下快速分离肱骨及股骨，剪去两端骨骺，用α-MEM培养液(含1000 U/mL链霉素、1000 U/mL青霉素、15%胎牛血清)反复冲洗骨髓腔至颜色发白。收集骨髓细胞冲洗液，吹打混匀，过滤，离心弃上清;用α-MEM培养液重悬2次后接种于培养皿中，在5%CO2、37℃孵箱培养24 h，收集培养液，离心，重悬，计数，镜下调节单核细胞密度至2.0×106/mL。接种0.5 mL细胞悬液于24孔培养板中(12个含骨磨片)。设热处理组和超声裂解组各5个副孔，其中1个空白对照，其他4孔分别加入热处理MTB冻干物和超声裂解MTB冻干物，调整MTB浓度至0.2、2、20、200 μg/mL，置入 5%CO2、37 ℃孵箱中培养，每48 h更换细胞培养液1次，始终维持各组MTB冻干物浓度不变，诱导7 d。

1.2.4 TNF-α 定量检测 收集诱导 24、48 h后的细胞培养液，采用ELISA法检测细胞培养液中的TNF-α浓度。首先于酶标仪中测定ELISA试剂盒中标准品在450 nm波长处的吸光度(OD)值，以OD值为纵坐标，标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线。根据样品的OD计算对应浓度值。

1.2.5 TRAP染色及骨陷窝的观察、计数 细胞诱导7 d，倾去培养板中的培养液，用去离子水冲洗细胞3次，依照TRAP染色试剂盒说明书配置固定液及染色液，并将染色液水浴至37℃。固定液固定细胞30 s，弃固定液，冲洗3遍。每孔加入150 μL染色液，用锡箔纸包裹培养板后，置于37℃孵育箱中反应60 min，去离子水冲洗晾干。将骨磨片放入0.25 mol/L氨水中超声洗涤5 min×3次，去除附着细胞，用1%甲苯胺蓝溶液室温染色3～4 min，1%盐酸乙醇分化，丙酮脱水，蒸馏水清洗，室温晾干。镜下观察每孔中TRAP阳性细胞(阳性细胞核≥3个)计数及骨陷窝情况。

1.2.6 统计学方法 采用SPSS21.0统计软件，结果用表示，组间比较采用方差分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 热处理组和超声裂解组TNF-α浓度比较 诱导24 h后，热处理组中各浓度组与空白对照组比较均无统计学差异(P均 ＞0.05);超声裂解组中除0.2 μg/mL组TNF-α浓度与空白对照组无统计学差异(P＞0.05)外，其余各浓度组均高于空白对照组(P均 ＜0.05)，且随 MTB 浓度增加，TNF-α 浓度逐渐增加，不同浓度组间比较均有统计学差异(P均＜0.05)。诱导 48 h 后，超声裂解组中除 0.2 μg/mL组TNF-α浓度与空白对照组无统计学差异(P＞0.05)外，其余各浓度组均高于空白对照组(P均＜0.05)，且随 MTB浓度增加，TNF-α 浓度也逐渐增加，不同浓度组间比较均有统计学差异(P均 ＜0.05)。见表1。

2.2 热处理组和超声裂解组TRAP阳性细胞比较诱导7 d后，热处理组中的实验组和空白对照组均有少量TRAP阳性细胞形成，各组间比较无统计学差异(P均＞0.05)。超声裂解组中各实验组均有TRAP阳性细胞形成，除0.2 μg/mL组与空白对照组比较无统计学差异(P ＞0.05)外，2、20 μg/mL组与空白对照组比较均有统计学差异(P均＜0.05)，200 μg/mL 组在诱导培养 3 d 后，培养液中出现大量漂浮死亡细胞，镜下观察细胞形态及结构模糊、裂解。

表1 热处理组和超声裂解组诱导24、48 h后培养液中的TNF-α浓度比较(pg/mL，)

表1 热处理组和超声裂解组诱导24、48 h后培养液中的TNF-α浓度比较(pg/mL，)

注:与空白对照组比较，*P ＜0.05;超声裂解组0.2、2、20、200 μg/mL 组间比较，P ＜0.05

组别 n 诱导24 h的TNF-α浓度 诱导48 h的TNF-α浓度5.160.2 μg/mL 组 30 77.72 ±3.67 94.06 ±6.54 92.24 ±7.68 104.06 ± 6.862 μg/mL 组 30 79.20 ±5.20 122.95 ±5.67* 96.45 ±9.79 314.95 ±10.82*20 μg/mL 组 30 77.40 ±5.03 150.54 ±6.62* 93.07 ±9.78 570.06 ±17.08*200 μg/mL 组 30 79.76 ±4.06 224.75 ±9.06* 96.54 ±9.67 633.64 ±20.17热处理组 超声裂解组空白对照组 30 76.78 ±4.56 92.91 ±4.25 95.81 ±5.84 102.62 ±热处理组 超声裂解组*

2.3 热处理组和超声裂解组骨吸收陷窝计数比较诱导7 d后，各组骨片均出现圆形、椭圆形或腊肠形的连续或不连续骨陷窝，热处理组各浓度组与空白组比较均无统计学差异(P均＞0.05)。超声裂解组中除0.2 μg/mL组与空白组无统计学差异(P＞0.05)外，其余各浓度组与空白组比较均有统计学差异(P均＜0.05)，且随浓度增加，骨陷窝计数逐渐增大，但200 μg/mL组与20 μg/mL组比较明显减少。见表2。

表2 热处理组和超声裂解组破骨细胞、骨陷窝计数比较(个，)

表2 热处理组和超声裂解组破骨细胞、骨陷窝计数比较(个，)

注:与空白对照组比较，*P ＜0.05;超声裂解组0、2、20、200 μg/mL 组间比较，P ＜0.05

组别 n 破骨细胞计数骨陷窝计数30 3.67 ±1.37 3.51 ±2.24 4.50 ±2.26 5.27 ±2.160.2 μg/mL 组 30 3.83 ±2.64 8.17 ±2.79 5.83 ±1.47 7.17 ±1.172 μg/mL 组 30 4.33 ±2.50 17.00 ±4.89* 5.50 ±1.05 13.17 ±2.22*20 μg/mL 组 30 4.17 ±2.78 28.67 ±5.89* 5.67 ±1.86 28.33 ±4.22*200 μg/mL 组 30 4.67 ±1.97 0* 5.83 ±1.72 3.83 ±1.83热处理组 超声裂解组空白对照组热处理组 超声裂解组*

3 讨论

骨关节结核患者骨质破坏的具体机制尚不明确。破骨细胞的成熟和活化主要依赖于成骨细胞表达核因子κB受体激活剂配体与破骨前体细胞表面核因子κB受体的结合，通过经典信号通路或旁路，导致破骨细胞成熟和活化［5］。当破骨细胞骨吸收活动与成骨细胞骨形成活动的动态平衡紊乱时，易导致骨吸收发生［6］。TNF-α在控制MTB感染过程中起重要作用。Al-Attiyah等［7］将肺结核患者的外周血单核细胞与MTB相关抗原体外共同培养2 d后，与空白组比较，实验组细胞培养液中的TNF-α浓度明显增高。本研究中，热处理组与空白对照组相比，破骨细胞数目、培养液中的TNF-α浓度、骨陷窝计数均无统计学差异，表明热处理MTB冻干物不能刺激骨髓单核细胞分泌TNF-α和诱导破骨细胞形成;超声裂解组与空白对照组比较，破骨细胞数目、培养液中的TNF-α浓度、骨陷窝计数均高于对照组(0.2 μg/mL组除外)，表明超声裂解MTB冻干物能刺激骨髓单核细胞分泌TNF-α和诱导破骨细胞形成，并导致骨质破坏。

超声裂解组中，随着MTB浓度和培养时间延长，细胞培养液中的TNF-α浓度逐渐增高，破骨细胞数量和骨陷窝计数逐渐增加。表明超声裂解MTB冻干物能刺激骨髓单核细胞分泌TNF-α与受体结合，直接或间接激活 NF-κB、JNK、p38、ERK 等信号通路而调节破骨细胞形成、激活，从而调控破骨细胞形成及活化，导致骨质破坏。当超声裂解MTB冻干物达到200 μg/mL时，诱导3 d后培养液出现大量漂浮死亡细胞，骨陷窝数明显降低。其原因可能为培养液中TNF-α浓度过高致骨髓单核细胞及诱导形成的破骨细胞死亡［8］，也可能与高浓度超声裂解MTB冻干物直接或间接导致细胞死亡有关。

MTB感染人体后，通过激活MAKP信号传导通路促进单核细胞趋化因子、TNF-α合成及释放，从而调控巨噬细胞、淋巴细胞对炎症的反应，抑制细菌生长和诱导肉芽肿形成［9］。结核病是一种慢性疾病，MTB在肉芽肿和吞噬细胞中持续存在，MTB或其胞内蛋白很可能导致TNF-α高于正常水平;而TNF-α又能通过细胞间信号传导诱导破骨细胞形成及活化，从而导致骨质破坏。这可能是MTB感染人体引起骨关节坏死的原因之一。

［1］Global tuberculosis control:WHO report 2011:20-24.

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