张 建 吴志刚 赵 鑫 马 铭 宁 伟 *

（1沈阳农业大学园艺学院，辽宁沈阳 110866；2农业部东北野菜种质异位保存 圃 与鉴定中心，辽宁沈阳 110866）

我国有蒲公英属植物70种，1变种，其中东北地区分布蒲公英11种。蒲公英已被我国《药典》（2010年版）和《兽药典》（2010年版）收录为大宗药材，同时被国家卫生部列为药食同源食品，广泛应用于传统中药以及饲料添加剂原料（张波 等，2011）。目前国内外对蒲公英的研究主要集中在化学成分、药理活性、组织培养、加工技术等方面（陈华和李银心，2004）。蒲公英属植物存在无融合生殖、有性生殖和兼性生殖等生殖方式（黄群策，2000；胡适宜，2005），这是研究生殖类型非常宝贵的资源，但目前对其生殖特性未进行研究报道与详细阐述。Whitton等（2008）通过授粉套袋试验对欧洲蒲公英属植物繁育系统进行研究，初步得出二倍体蒲公英为有性生殖，多数三倍体蒲公英为专性无融合生殖，少数三倍体以及四倍体蒲公英为兼性无融合生殖的结论，但并未对无融合的生殖类型以及胚和胚乳倍性之比做进一步分析。本试验以东北地区广泛分布的朝鲜蒲公英为试材，通过染色体计数、人工授粉试验以及流式细胞仪检测等试验方法，确定其生殖类型，同时为蒲公英生殖遗传规律以及分子机制研究奠定良好基础。

1 材料与方法

1.1 材料

试材于2008年5～8月采于辽宁东部山区，经中国科学院沈阳生态研究所李冀云研究员鉴定为朝鲜蒲公英，栽种于东北野菜种质资源异位保存圃生态试验区，常规生态模式管理。2012年5月植株进入花期时进行各种观察测定。

1.2 套袋、去雄及人工授粉试验

2012年5月，朝鲜蒲公英处于盛花期，选择生长势良好的20株植株，每植株随机选取未开放的3朵花，将60朵花分成6组（每组10朵），以自然条件下朝鲜蒲公英花序为对照，分别设5个处理：①不去雄套袋；②去雄套袋；③人工自交授粉套袋；④人工异交授粉套袋；⑤去雄去柱头。为防止花葶倒伏，用木棍对花葶进行固定，待种子成熟后，统计结籽率。

1.3 染色体数目观察

采用常规压片法进行根尖染色体观察（宁伟 等，2012）。

1.4 流式细胞仪检测

以整个果序成熟种子（100粒左右）为材料，取植株2 g嫩叶为对照，在Chopping Buffer缓冲液（1.5 mL）中剪碎，经300目筛网过滤，1 000 r·min-1离心10 min，弃上清，余下DNA加PI染色（一个样加1 mL），摇匀，避光15 min，然后经500目筛网过滤，摇匀，上机检测。每次测定20 000个细胞。检测结束后在流式细胞仪上得到各峰值相对倍性。

2 结果与分析

2.1 套袋、去雄及人工授粉试验

由表1可见，自然条件下的结籽率为97.66%，除了人工异交授粉+套袋处理的结籽率较高，为86.56%外，其他处理结籽率均在50%左右。表明朝鲜蒲公英具有兼性无融合生殖现象，其无融合生殖发生率大约在50%左右，其生殖方式属于无融合+专性异交类型。

2.2 染色体计数观察

通过根尖细胞染色体观察，确定朝鲜蒲公英染色体数目为32（图1）。蒲公英属植物染色体组基数为8，所以朝鲜蒲公英为四倍体。

表1 蒲公英不同授粉处理下的结籽率

2.3 朝鲜蒲公英后代检测

胚囊类型、胚乳发育受精与否对胚乳细胞倍性水平影响较大（Urbani et al.，2002）。朝鲜蒲公英种子检测出3个峰（图2）。第一个峰值400，第二个峰值为590，第三个峰值为770，三者相比为1∶1.475∶1.925，3种倍性水平之比接近2C∶3C∶4C。二倍体峰反映的是胚的倍性情况，三倍体峰和四倍体峰表示胚乳细胞具有不同倍性水平。说明种子的胚和胚乳形成存在有性生殖情况，因此种子细胞中检测到3种倍性峰。结果表明朝鲜蒲公英属于兼性无融合生殖，且胚乳为自主发育。

图1 朝鲜蒲公英根尖染色体数目

图2 朝鲜蒲公英叶片以及种子DNA含量分布

3 结论与讨论

朝鲜蒲公英去雄套袋结籽率为48.79%，表明其具有无融合生殖现象。植物无融合生殖特性与其倍性有特殊关系（刘传虎 等，2007）。本试验染色体观察表明朝鲜蒲公英为四倍体，与少数三倍体以及四倍体蒲公英为兼性无融合生殖的结论一致（Whitton et al.，2008），流式细胞仪检测结果表明朝鲜蒲公英为兼性无融合生殖类型，这与兼性无融合生殖植物山柳菊种子检测结果一致（Matzk et al.，2000）。 本试验为蒲公英无融合生殖胚乳自主发育提供了直接证据。

兼性无融合，就是有两套生殖系统，除了真正的无融合后代，还有非母本的后代（Crane，2001）。这种兼性无融合生殖方式对于入侵新的生境条件是非常有益的（Wilson et al.，2006）。在兼性无融合中，有性和无融合胚囊发育时间是不同的，授粉时间对于决定有性/无融合的比例具有重要作用（Bicknell & Koltunow，2004；Krahulcová et al.，2004）。环境以及花粉量对无融合的发生率可能也有一定影响，这还需要进一步的试验进行论证。

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