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RP-HPLC法同时测定淫桂通便颗粒中6种成分

2013-08-28谈瑄忠毛春芹陆兔林王会娟胡颖菲

中成药 2013年2期
关键词:肉桂酸藿苷葛根素

王 蕾, 谈瑄忠, 毛春芹, 陆兔林, 王会娟, 胡颖菲

(1.南京中医药大学药学院,江苏南京 210046;2.南京市中医院,江苏南京 210001)

淫桂通便颗粒由肉桂、淫羊藿、厚朴、葛根、薤白、茯苓共六味饮片组成,具有温补脾肾、润肠通便之功效,用于治疗脾肾阳虚型便秘。本方为南京市中医院院内经验方,已在临床使用多年,对脾肾阳虚便秘具有治疗作用,且能温阳活血标本兼治。肉桂、淫羊藿是方中重要药物,肉桂具有补火助阳,引火归源,散寒止痛等作用,其有效成分为肉桂醛[1-2];淫羊藿有补肾阳的作用,其有效成分是淫羊藿苷[3-5]。目前采用薄层鉴别法对其中几味药进行了质量控制,而且现行采用HPLC法对制剂的质量控制大多只测一种成分,不能全面反应控制复方质量[6-7],为了更好控制本品质量,本研究采用HPLC法同时定量测定方中葛根素、淫羊藿苷、肉桂酸、肉桂醛、和厚朴酚与厚朴酚,效果理想,达到了全面控制该制剂质量的目的,可为临床安全用药提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent-1100型高效液相色谱仪 (美国安捷伦公司,包括四元梯度泵、真空脱气机、自动进样器、柱温箱、VWD检测器);Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)(淮阴汉邦科技有限公司);紫外分析仪WD-9403C型 (北京市六一仪器厂);水浴锅 (巩义市英峪予华仪器厂);FA1104型万分之一电子分析天平 (上海天平仪器厂);KQ-500E型医用超声清洗器 (昆山超声仪器有限公司)。

1.2 试药 葛根素对照品(批号110752-200511)、淫羊藿苷对照品 (批号 110737-200312)、肉桂酸对照品 (批号110786-200503)、肉桂醛对照品 (批号110795-201007)、和厚朴酚(批号 110730-201011)、厚朴酚 (批号 110729-200411)均由中国药品生物制品检定所提供。乙腈为色谱纯,水为重蒸馏水,甲醇、磷酸为分析纯。淫桂通便颗粒为医院自制 (批号为120322、120325、120329,规格为:10g/袋)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Kromasil C18色谱柱 (250 mm×4.6 mm,5 μm);柱温35℃;流动相为乙腈 -0.1%磷酸水溶液,梯度洗脱,洗脱程序见表1;体积流量1.0 mL/min;进样量10 μL;检测波长290 nm。对照品色谱图、样品色谱图及阴性样品色谱图见图1。

表1 梯度洗脱时间顺序Tab.1 Mobile phase in gradient elution mode

图1 高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatograms

2.2 混合对照品贮备液的制备 分别精密称取葛根素、淫羊藿苷、肉桂酸、肉桂醛、和厚朴酚及厚朴酚对照品适量,加甲醇制成质量浓度分别为每1 mL含葛根素0.039 0 mg、淫羊藿苷0.217 5 mg、肉桂酸0.184 2 mg、肉桂醛0.012 5 mg、和厚朴酚0.556 9 mg以及厚朴酚0.446 2 mg的对照品贮备溶液。精密量取上述对照品溶液适量置5 mL量瓶中,甲醇定容,混匀,制成每1 mL含葛根素、淫羊藿苷、肉桂酸、肉桂醛、和厚朴酚及厚朴酚分别为 7.8、43.5、36.84、2.5、55.69、44.62 μg 的混合对照品贮备液。

2.3 供试品溶液的制备 取供试品约2 g,精密称定,置于具塞锥形瓶中,精密加入甲醇50 mL,称定质量,超声处理20 min,放冷至室温,以甲醇补足减失的质量,摇匀,过滤,弃去初滤液,取续滤液,再用0.45 μm微孔滤膜滤过,取续滤液作为供试品溶液。

2.4 阴性对照溶液的制备 按处方比例分别称取除葛根、淫羊藿、肉桂、厚朴以外的其余药味,按照淫桂通便颗粒的制备工艺,制备不含葛根、淫羊藿、肉桂、厚朴的阴性样品。按2.3项下方法制成缺葛根、淫羊藿、肉桂、厚朴的阴性对照溶液。

2.5 线性关系考察 精密量取混合对照品1 mL,稀释1倍,分别进样4、6、8、10、20 μL,测定峰面积。以峰面积对质量浓度进行线性回归,得回归方程分别为:葛根素Y=57.66X+4.591 2,r=0.999 9;淫羊藿苷Y=11.797X-4.503 1,r=0.999 6;肉桂酸Y=71.527X-24.91,r=0.999 7;肉桂醛Y=2 701.2X-40.667,r=0.999 8;和厚朴酚Y=19.014X-5.793 7,r=0.999 7;厚朴酚Y=22.207X+3.905 2,r=0.999 7。结果表明,葛根素在1.56~7.80 μg、淫羊藿苷在8.70~43.50 μg、肉桂酸在7.37~36.84 μg、肉桂醛在 0.5~2.5 μg、和厚朴酚 8.92~44.62 μg、厚朴酚在11.14 ~55.69 μg 范围内线性关系良好。

2.6 精密度试验 精密吸取同一样品溶液10 μL,连续进样6次,记录各峰面积,并计算各RSD值。结果葛根素、淫羊藿苷、肉桂酸、肉桂醛、和厚朴酚及厚朴酚峰面积RSD分别为0.79%、0.97%、1.24%、0.01%、0.01%、1.21%,表明仪器精密度良好,符合定量测定要求。

2.7 稳定性试验 取同一样品溶液,于室温下放置,分别于0、2、4、8、12、24 h进样分析,结果表明所测6种成分在24 h内稳定。葛根素、淫羊藿苷、肉桂酸、肉桂醛、和厚朴酚及厚朴酚峰面积的 RSD分别为 2.60%、0.41%、2.89%、2.12%、2.91%、2.64%。

2.8 重复性试验 取同一批供试品,按2.3项下方法,平行制备6份供试品溶液,按上述色谱进样分析,葛根素、淫羊藿苷、肉桂酸、肉桂醛、和厚朴酚及厚朴酚质量分数分别为0.548 3、0.622 4、0.414 7、0.023 7、0.238 2、0.534 3 mg/g;RSD 分别为2.94%、1.83%、2.85%、2.54%、2.26%、1.93%,表明该方法重复性良好。

2.9 准确度试验 分别精密称取6种对照品适量,置同一量瓶中,配置成分别含葛根素、淫羊藿苷、肉桂酸、肉桂醛、和厚朴酚及厚朴酚0.242 0、0.339 8、0.275 3、0.010 1、0.213 0、0.220 3 mg/mL的混合对照品溶液,备用。精密称取已测定的样品9份,每份约1 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,分别加入混合对照品溶液0.8 mL、1 mL、1.2 mL,按2.3项下方法制备供试品溶液,进样记录色谱峰,计算各回收率。结果葛根素、淫羊藿苷、肉桂酸、肉桂醛、和厚朴酚及厚朴酚的平均加样回收率依次为 97.20%、98.78%、97.48%、97.39%、98.81%、98.40%,RSD分别为2.15%、0.79%、1.71%、1.47%、0.82%、0.91%。

2.10 样品测定 取各批淫桂通便颗粒样品(120322、120325、120329),精密称取约2 g,按2.3项下方法制备供试品溶液,分别取供试品溶液和对照品溶液各10 μL,按上述色谱条件进样分析,记录色谱峰,根据外标两点法计算样品中6种成分的含量,结果见表2。

表2 3批淫桂通便颗粒样品测定结果(n=3)Tab.2 Determination results of the three batches of samples in Yingui Tongbian Granules(n=3)

3 讨论

3.1 检测波长的选择 对检测波长选择时,由于淫桂通便颗粒成分复杂,其主要有效成分的紫外吸收差异很大,试验中对混合对照品进行吸收光谱扫描,结果表明在260 nm以下淫羊藿苷、肉桂醛等被测灵敏度大大降低,和厚朴酚、厚朴酚基本检测不出;在290 nm处有被测各种成分均能出峰,为了使各组分在同一波长下都能有较好吸收,达到吸收强、干扰小的目的,故选择290 nm作为检测波长。

3.2 提取方法的选择 根据文献报道[8-9],本实验分别考察了提取溶剂甲醇和乙醇,结果表明甲醇提取率比乙醇提取率高,甲醇提取的供试品进入液相杂质干扰少,所以选择甲醇作为提取溶剂;同时考察了提取方式[10](冷浸提取、超声提取和回流提取)、提取时间 (20、30、40 min)对提取结果的影响,结果表明超声提取与回流提取对提取率没有显著差异;超声提取20、30、40 min对提取率没有显著差异。综合考虑提取时间、成本、提取率,选择甲醇超声提取20 min。

3.3 流动相的选择 参考文献[11-12]比较了多种流动相系统,包括甲醇-水、乙腈-水、乙腈-磷酸水溶液,结果表明采用乙腈-磷酸水溶液,基线平稳,大多数化合物具有更高的灵敏度,且肉桂酸的峰型较好,各峰均没有拖尾,各峰间的分离度均达到1.5以上,故选择流动相为乙腈-0.1%磷酸水梯度洗脱。

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