史长灿， 赵瑞芝，2， 卢传坚，2*

(1.广州中医药大学第二临床医学院，广东广州 510405;2.广东省中医药科学院，广东广州 510006)

银屑灵片为广东省中医院制剂，此方多用于治疗血虚风燥型银屑病，在临床以及实验研究证实，疗效确切［1-8］。目前是我院治疗银屑病的常规用药，其主要由赤芍、土茯苓、莪术等成分组成。银屑灵复方中含有的成分芍药苷，具有抗炎、抗过敏，调节免疫、抑制角质颗粒细胞增生等与银屑病治疗相关的药理活性［9-14］，是银屑灵的主要活性成分之一。药物体内分布与药效和毒性息息相关，为了给银屑灵的后期开发奠定基础，本实验建立了芍药苷体内分布研究方法，并进行了其体内分布的研究。

1 材料与仪器

1.1 动物 SD雄性大鼠，SPF级，体质量 (300±40)g，广东省医学实验动物中心 ［合格证号:0081750］，自由饮水进食。

1.2 仪器 Agilent1200HPLC，VWD检测器 (Agilent);匀浆仪 (IKA，T10);涡旋器 (IKA型号GENIUS3);单道移液器 ACURA 825(20 ～200 μL，100 ～1 000 μL，瑞士);电子分析天平 (BT—125D);waters HLB spe柱;超低温冰箱 (U-570，NEW BRUNSWICK);高速离心机 (G20);Waters20固相萃取仪 (Waters);超纯水机 (Milli-Q，Millipore)。

1.3 试剂与药品 银屑灵药材 (康美药业)，药物提取液(广东省中医院中药制剂实验室制备);芍药苷 (纯度96.5%，南京泽郎医药科技有限公司);甲醇 (色谱级，天津四友);乙腈 (色谱级，迪马);乙酸 (色谱纯，天津富宇精细化工试剂公司)，其他试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 分离条件 色谱柱Kinetex C18，(2.6 μm，4.6 mm×100 mm)，检测器 VWD，柱温 30℃，体积流量 1.2 mL/min，检测波长275 nm。甲醇-乙腈-0.5%冰乙酸梯度洗脱，见表1。

表1 流动相条件

2.2 标准品溶液配制 精密称取适量芍药苷，用70%甲醇溶解制成质量浓度为1.6 mg/mL对照品贮备液，放置4℃冰箱中保存。

2.3 给药与样品采集 12只SD雄性大鼠随机分为两组。一组按照8.3 g/kg灌胃给予银屑灵连续灌胃6 d，最后一次灌胃2 h后麻醉处死，取出心、肝、脾、肺、肾、脑各组织，另一组按照110 g/kg剂量一次给予大鼠银屑灵，给药后2 h处死动物，同上述操作取材，分别将心、肝、脾、肺、肾、脑用生理盐水清洗，用滤纸吸去表面水分，放置在－80℃冰箱中备用。

2.4 样品处理

2.4.1 样品准备 将置－80℃冰箱中保存的组织放至室温并用滤纸吸干水分，取1 g左右并精密称定质量，加入10倍体积 (w/v)生理盐水，在冰浴中进行匀浆。

2.4.2 处理方法 加入1.0 mL甲醇将spe萃取柱进行活化，再加入1.0 mL纯水洗去甲醇，将组织液高速离心后取200 mL加入到spe柱，静置流出组织液后，加1.0 mL的水，静置流出并抽去水分，加1.0 mL甲醇洗脱spe柱并用EP管收集，置氮吹仪下吹干，再用200 μL的70%甲醇溶解，过 0.22 μL 滤膜，进样 10 μL。

3 结果

3.1 方法专属性 取空白组织液和加入对照品的组织液按照2.4.2项方法处理后分别进样测定，以肝脏组织为例，色谱图见图1。结果表明，芍药苷的保留时间是3.20 min，组织中的内源性物质对测定结果没有影响，专属性较好。其他组织专属性图与肝脏相近。

图1 大鼠肝脏样品色谱图

3.2 标准曲线与线性范围 将大鼠空白组织液，加入系列芍药苷对照品储备溶液，配制成质量浓度为1.6、3.2、8.0、16、40、80、160 μg/mL系列标准组织溶液，按照2.4.2项方法处理样品，以芍药苷质量浓度 (X)为横坐标，以待测图谱峰面积 (Y)为纵坐标，采用加权 (1/x2)最小二乘法进行回归，得回归方程。各组织标准曲线和相关系数见表2。

3.3 精密度与准确度 根据不同组织的标准曲线范围，取三份组织匀浆液加入不同质量浓度的芍药苷对照品溶液，制备成3.2、16、80 μg/mL的低、中、高3个质量浓度的QC样品，并将3个质量浓度分别制备5份，按2.4.2项下处理后，连续测定3 d，分别计算日内精密度、日间精密度及准确度。见表3。

表2 不同组织的标准曲线及相关系数

3.4 提取回收率 取芍药苷对照品组织液低、中、高3个质量浓度的QC样品，每个质量浓度5份，按2.4.2项下的方法处理，进样测定得到相应峰面积A;另取相同低、中、高3种质量浓度的芍药苷对照品，上样测定得到相应峰面积B，将峰面积A与B比较，得到提取回收率，见表3。芍药苷在不同组织中的提取回收率在78.3%～88.7%。

表3 精密度、准确度及提取回收率 (n=6)

3.5 稳定性 分别将芍药苷低、中、高3个质量浓度的QC样品循环冻融3次 (－80℃)，以相同方法处理分析，结果显示，测定值和真实值RSD均小于11%，说明样品在考察的条件下比较稳定;处理后的样品在4℃放置24 h，室温放置12 h，经分析样品都比较稳定。

3.6 大鼠以8.3 g/kg剂量 (临床剂量)灌胃银屑灵，2 h后仅血液中可检测到芍药苷，组织内未见芍药苷，按常规剂量标准给药未能测出组织分布;一次大剂量给予银屑灵110 g/kg后，组织中芍药苷质量浓度结果见图2。

图2 灌胃银屑灵后大鼠各组织芍药苷质量浓度

4 讨论

姜清华、邓晶晶等进行了大鼠灌胃赤丹丸芍药苷的体内分布研究，其结果与本实验的不同，由于灌胃的药物处方相差比较大，配伍的成分可能会对芍药苷组织分布内有较大的影响。

按照临床剂量换算的动物剂量给予大鼠银屑灵，芍药苷仅在血液中可检测到，说明正常剂量时芍药苷仅分布于血液，提示后续工艺研究可直接用血液药代动力学数据代表服用银屑灵后芍药苷的体内过程进行制剂工艺的优化。

大剂量时芍药苷主要分布于肝、肾。芍药苷具有肝保护作用，大剂量时主要分布于肝脏，对于减少处方中其它药物的肝损伤有积极意义。

［1］王 蕾，黄咏菁，王敏华.银屑灵片治疗寻常性银屑病的临床观察［J］.广州中医药大学学报，2009，11(26):520.

［2］闫玉红，卢传坚.银屑灵片优化方治疗寻常型银屑病的临床探索性研究［J］.中药新药与临床药理，2011，22(6):695-698.

［3］卢传坚，刘凤年.银屑灵片对上皮细胞有丝分裂的影响［J］.中医药临床杂志，2007，19(1):25-26.

［4］卢传坚，闫玉红.“银屑灵片”止痒作用的实验研究［J］.中国药房，2008，19(6):409-410.

［5］韩 凌，彭 燕，赵瑞芝，等.银屑灵全方及拆方对角质细胞HacaT增殖的影响［J］.广州中医药大学学报，2011，28(2):159-162，166.

［6］卢传坚，吴小霞，刘凤年.银屑灵片治疗寻常性银屑病的临床观察［J］.广州中医药大学学报，2009，11(26):520.

［7］卢传坚，刘凤年.“银屑灵片”中药提取液对肿瘤坏死因子-α刺激后角朊细胞分泌细胞因子IL-8的影响［J］.辽宁中医杂志，2009，36(11):1862-1863.

［8］卢传坚，闫玉红，赵瑞芝.银屑灵片对鼠尾鳞片表皮颗粒层形成的影响［J］.中药新药与临床药理，2010，21(3):231-233.

［9］郑世存，李晓宇，欧阳兵，等.芍药苷药理作用研究新进展［J］.中国药物警戒，2012，9(2):100-103.

［10］杨 军，何丽娜，江 怡，等.赤芍总苷对大鼠皮层神经细胞钙超载损伤的保护作用［J］.中药新药与临床药理，2001，12(3):212-215.

［11］王丽雯，袁 昉，魏 伟.重组人白细胞介素对人外周血淋巴细胞功能的影响及芍药苷的作用［J］.中国临床药理学杂志，2009，25(2):129-133.

［12］贾 敏，张 寒，褚 静.芍药苷对大鼠慢性肝损伤及肝纤维化的保护作用［J］.现代中西医结合杂志，2011，20(36):4618-4619.

［13］惠爱武，冯文革，赵 岗，等.芍药苷对荷瘤小鼠化疗的减毒增效作用研究［J］.陕西中医，2011，32(7):925-926.

［14］张 斌，李红梅，王 媛，等.芍药苷减轻小鼠LPS性急性肺损伤的作用机制研究［J］.中国病理生理杂志，2011，27(10):1956-1960.