林叶新， 夏之宁，*， 陈 华， 杨丰庆

(1.重庆大学生物工程学院，重庆 400030;2.重庆大学化学化工学院，重庆 400030)

黄连为毛莨科植物黄连Coptis chinensisFranch的干燥根茎［1］。小檗碱为黄连中含有量最高的原小檗碱型生物碱，也是最重要的活性成分之一，具有抗炎、抗菌、抗癌，治疗糖尿病和心血管疾病，及抑制脂肪分化等多方面药理作用［2－6］。

传统用于提取黄连小檗碱的方法有稀硫酸法、乙醇浸提法、水提法等［7－9］，这些方法有一定的局限性，如消耗溶剂量大、耗时长、提取率低等。因此，为提高黄连小檗碱的提取率，一些现代化方法，如有超声波提取法、超微振动法、亚临界水提取法、加速溶剂萃取法、微波－索氏工艺联合提取法等［10－13］也被采用于黄连小檗碱的提取中。尤其是微波辅助提取，因微波具有能促进植物细胞破裂，提高有效成分从物料内部向提取溶剂界面的扩散速率，减少提取溶剂的使用量［14］等优点，在天然产物提取中得到广泛的应用。

虽然已有采用微波辅助提取黄连中的生物碱的报道，但在微波提取工艺中，因微波时间过长，容易引起爆沸现象，通常只能采取间歇式微波提取［15］。所以常规的微波辅助提取，一般有两种:直接采用微波提取的方式［15］;或是先用微波处理样品，提高物料的扩散率，再用其他方法 (如索氏抽提)提取目标物［16］。这类微波提取方式，耗时长、操作步骤繁琐。

本实验采用微波辅助回流法提取，对黄连中的小檗碱进行提取，并通过单因素及正交设计法确定提取的最佳工艺。研究中采用的TCMC—204型温控式微波化学反应器是可控温式的，能有效避免爆沸现象，并降低了高温破坏目标产物的可能性。通过与传统提取工艺的对比，发现此方法提取时间短，提取率高，优于其他提取方式。此外，本研究还采用了AB－8大孔吸附树脂对黄连生物碱进行分离纯化。通过比较小檗碱的提取率和纯化后的纯度，得到一种快速简单有效地提取及纯化川黄连中小檗碱的方法。

1 材料与方法

1.1 材料 川黄连购买于重庆康济跃洪药业有限公司。将黄连粉碎，过50目筛。盐酸小檗碱标准品 (纯度≥98%，上海源叶生物科技有限公司)、乙腈 (分析纯，上海陆都试剂化工厂)、冰醋酸(分析纯，重庆川东化工有限公司)、无水乙醇(分析纯，重庆川东化工有限公司)、AB－8大孔树脂 (天津市光复精细化工研究所)。

1.2 仪器 TCMC—204型温控式微波化学反应器(南京陵江科技开发有限责任公司)、LC—900B高效液相色谱仪 (配LB 900型紫外检测器，重庆川仪九厂)、HW—2000色谱工作站 (南京千谱软件有限公司)、SHZ－D(Ⅲ)循环水式真空泵 (巩义市予华仪器有限责任公司)、UV—2450紫外分光光度计 (日本岛津公司)、AY120电子天平 (日本岛津公司)

1.3 方法

1.3.1 色谱条件 Kromasil C18色谱柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，柱温25℃;流动相为乙腈－水 (30∶70)含0.6% 冰醋酸，体积流量1.0 mL/min;检测波长342 nm。

1.3.2 对照品工作曲线的测定 准确称取2.5 mg盐酸小檗碱标准品，用色谱流动相溶解成0.025 mg/mL的盐酸小檗碱母液，备用。使用时，用色谱流动相逐级稀释至所需的质量浓度。用 RPHPLC测定盐酸小檗碱的量，每个样品测定3次。以盐酸小檗碱峰面积对质量浓度拟合工作曲线。

1.3.3 微波辅助回流法提取 准确称取川黄连药粉 (3.0 g)，在设定条件下，采用TCMC—204型温控式微波化学反应器，对黄连小檗碱进行提取。提取工艺优化时，先通过单因素试验 (考察乙醇浓度、微波回流时间、提取温度、料液比、提取次数等因素)选取影响黄连小檗碱提取率的因素和水平，再进行正交试验，确定最佳提取工艺。提取率计算公式为 (提取所得小檗碱的质量/生药质量)×100%。单因素初始条件为乙醇40%，微波时间10 min，温度为70℃，料液比为1∶20，提取次数为1次。

1.3.4 回流提取及水浴加热提取 准确称取黄连药粉 (3.0 g)，进行回流提取和水浴加热提取1 h，各进行平行试验3次。其他提取条件与通过正交试验获得的微波辅助回流提取条件如温度、乙醇质量分数、料液比、提取次数等保持一致。测定提取液中小檗碱的量，计算提取率。

1.3.5 AB－8大孔树脂纯化工艺 (1)大孔吸附树脂预处理:将大孔吸附树脂用95%乙醇浸泡24 h，使其充分溶胀，再用乙醇洗至溶液加适量蒸馏水无白色浑浊现象时为止，最后用蒸馏水洗至无醇味，备用。(2)最大上样量的考察:AB－8树脂湿法装柱，将微波辅助回流法提取得到的样品浓缩至小檗碱质量浓度为2.9 mg/mL，之后把浓缩液100 mL缓慢加入装有10 mL湿AB－8的树脂的玻璃柱中，控制体积流量为1.0 mL/min，每树脂床体积(Bed volume，BV)即10 mL收集1个流分，并用RP－HPLC法测定每1 BV中小檗碱的量。根据每1 BV中小檗碱的量确定最大上样量。(3)水洗脱用量的考察:将已吸附好黄连提取液的AB－8树脂，用蒸馏水洗脱杂质，洗脱液体积流量为1.0 mL/min。每1 BV收集一次，测定小檗碱泄漏情况。(4)洗脱剂体积分数的考察:根据确定的最大上样量上样，将吸附好黄连提取液的大孔树脂，用适量蒸馏水洗脱杂质，再分别用30%、50%、70%、90%的乙醇溶液作为洗脱液，洗脱液体积流量为1.0 mL/min，洗脱5 BV，并收集好。测定5 BV流分中小檗碱的总量。 (5)洗脱剂用量的考察:按 (3)和 (4)项所得的蒸馏水洗脱剂用量和乙醇洗脱剂体积分数，洗脱已吸附好黄连提取液的AB－8树脂，洗脱液体积流量为1.0 mL/min。每1 BV为一个考察单位，至洗脱液近无色，分别测定各BV洗脱液中小檗碱的量。(6)纯化试验及小檗碱回收率:取一定量的黄连提取浓缩液按最佳纯化条件进行吸附和洗脱，将洗脱液和上样前浓缩液分别旋转蒸发至黏稠状，移置真空干燥箱干燥，测定纯化前后提取物中小檗碱的量，并计算纯度及小檗碱回收率。

2 结果

2.1 小檗碱定量测定

2.1.1 RP－HPLC色谱条件 在选定的1.3.1项的色谱条件下，川黄连提取物中目标物小檗碱的峰与其他成分可实现基线分离。小檗碱色谱峰的tR值为8.6 min，见图1。

图1 川黄连微波辅助回流提取液 (A)与盐酸小檗碱标准品 (B)的RP-HPLC谱图对照Fig.1 RP-HPLC chromatograms of Coptis chinensis Franch from Sichuan Province extracts using microwave assisted reflux extraction(A)and berberine hydrochloride standard(B)

2.1.2 RP－HPLC外标法绘制小檗碱的标准曲线将小檗碱母液用流动相稀释成 12.50、6.25、3.125、1.562、0.781和0.391 μg/mL 6个质量浓度，分别进行RP－HPLC分析，在0.391～12.50 μg/mL范围内，小檗碱的量与其峰面积具有良好的线性关系Y=48 965X+6 396， (R2=0.999 3，n=6)，小檗碱质量浓度与其峰面积具有良好的线性关系。检测限 (3 δ)为0.038 μg/mL，定量限(10 δ)为 0.169 μg/mL。

2.2 微波辅助回流法提取工艺

2.2.1 单因素试验 依次考察了乙醇体积分数、微波回流时间、提取温度、料液比、提取次数等因素对川黄连中小檗碱提取率的影响。见图2。

图2 单因素试验Fig.2 Single factor experiment

通过与图1、2的结果比较来看，提取次数对提取率的影响并不是很大，考虑节约溶剂和能源的因素，将选择提取次数为2次，并不作为提取工艺的必要条件，加入到正交试验设计中。因此，最终确定正交试验的所选的因素水平为时间 (10 min、20 min和30 min)、温度 (60℃、70℃和80℃)、乙醇 (50%、60%和70%)，料液比 (1∶15、1∶20和1∶25)，提取次数为2次。

2.2.2 正交试验 根据单因素试验结果，直接设定提取次数2次。并选取微波时间 (A)、提取温度 (B)、乙醇体积分数 (C)、料液比 (D)4个因素进行正交试验。采用L9(34)正交表，以小檗碱的量为评价指标，观察以上4个因素对川黄连中小檗碱提取工艺的影响。因素水平见表1，并通过软件正交设计助手Ⅱ3.1设计试验，试验安排及结果见表2。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels of orthogonal test

由R值可知，各因素对提取率的影响大小为B＞A＞C＞D，即温度对小檗碱提取率的影响最大，其次是时间、乙醇浓度和料液比，通过k值可判断出最佳提取条件是A1B3C1D3，即微波回流10 min，提取温度80℃，50%乙醇，料液比1∶25，提取次数2次。

表2 L9(34)正交试验设计及结果Tab.2 Design and results of orthogonal test L9(34)

2.2.3 加标回收率实验 在优化的微波辅助回流提取条件下，加标样回收率在98.8% ～101.7%之间，平均加标回收率为100.2%，RSD为1.5%(n=3)，表明已优化的微波回流提取方法有较好的提取率及重复性。

2.3 与传统提取方法的比较

为更好的与传统提取方法相比较，3种提取方法中，除提取时间不同外 (微波回流提取法为10 min;单纯回流法及水浴加热法为1 h)，所使用的提取溶剂的浓度、料液比、温度及提取次数均与微波辅助回流提取正交试验设计所得的最优条件一致(提取温度80℃，50%乙醇，料液比1∶25，提取2次)。每种方法，均重复3次试验。结果显示，在其它提取条件都相同的情况下，微波辅助回流法提取时间仅为10 min时，提取率为8.5%，比单纯的回流1 h或水浴加热1 h对小檗碱的提取率都要高。这3种方法中，提取率最低的为水浴加热，仅为5.5%;而单纯回流法，提取率为6.2%。

2.4 小檗碱的纯化工艺

2.4.1 最大上样量的考察 按1.3.5项 (2)收集流分并测定每1 BV中小檗碱的量 (图3)。从第4 BV开始，小檗碱泄漏量高于1 mg，而到5 BV时，小檗碱检出量明显增多。考虑到生产工艺中要避免并尽量减少小檗碱的泄漏，确定最大上样体积为3 BV的川黄连提取液 (小檗碱质量浓度为2.9 mg/mL)，即最大上样量为8.7 mg小檗碱/mL树脂(湿体积)。

图3 小檗碱泄露曲线Fig.3 Curve of berberine leakage

2.4.2 水洗脱剂用量的考察 用水洗脱的目的是除去提取液中的杂质，提高小檗碱的纯度。按1.3.5项 (3)的方法收集流分，并测定小檗碱的量。结果如图4所示，随着水洗次数的增加，已吸附好的小檗碱亦部分被洗下，造成其损失量也增大，当水洗脱量达4 BV时，小檗碱损失率高于0.2 mg。虽然水洗脱量为3 BV时，已有部分小檗碱被洗脱下来，但接收流分期间，观察到在第3 BV时，所获得的溶液与第1和第2 BV一样有轻微浑浊状，说明其中仍存在少量的杂质。因此，为更好的洗脱杂质，提高小檗碱的纯度，并减少小檗碱的损失量，选择3 BV为洗脱杂质用水量。

图4 小檗碱泄露曲线Fig.4 Curve of berberine leakage

2.4.3 洗脱剂体积分数的考察 按1.3.5项 (4)的方法收集5 BV流分，并测定5 BV流分中小檗碱的总量。如图5所示，小檗碱洗脱量随乙醇体积分数的增加而增大，但当乙醇增至90%时，洗脱的小檗碱的量明显降低。这和小檗碱自身的性质有关，其在高体积分数的乙醇条件下溶解性能较差。另外，收集流分过程中发现，在90%乙醇洗脱液中出现明显的浑浊状。因此后续试验中选择70%的乙醇溶液作为洗脱液。

图5 洗脱剂体积分数的影响Fig.5 Effect of eluent concentration

2.4.4 洗脱剂用量的考察 由图6曲线可知，在用70%乙醇洗脱的过程中，前3 BV的洗脱液已可将绝大部分小檗碱解吸下来，所获小檗碱的质量浓度分别为4.78、2.73、0.42 mg/mL;而在第4 BV洗脱液中，小檗碱的质量浓度＜0.16 mg/mL，到了第5 BV时则检测不出洗脱液中含有小檗碱。因此，为节约成本，减少洗脱剂的损耗，故确定洗脱剂70%乙醇的用量为3 BV。

图6 小檗碱解吸曲线Fig.6 Berberine desorption curves

2.4.5 验证试验 在优化的工艺条件下对川黄连提取液中的小檗碱进行除杂纯化，即以8.7 mg/mL湿树脂小檗碱上样，先用3 BV蒸馏水洗脱杂质，再用3 BV的70%的乙醇解吸小檗碱，整个分离纯化过程控制体积流量为1.0 mL/min，经AB－8树脂分离纯化后，其干固物中小檗碱的纯度从19.3%提高至73.2%，目标物小檗碱的回收率为91.3%。有文献报道，用D101大孔树脂纯化黄连总生物碱，纯化后的黄连总生物碱纯度约为70%［17］。相比之下，本纯化工艺操作更简单，纯化效果好，可直接获得黄连中有效成分小檗碱的纯化物。

3 结论

本研究采用温控式微波化学反应器微波辅助回流提取川黄连中的小檗碱。并通过正交试验设计对黄连小檗碱的提取工艺进行考察，获得最佳提取工艺条件为微波回流10 min，提取温度80℃，50%乙醇，料液比1∶25，提取次数2。结果表明，在优化的提取条件下，小檗碱的提取率为8.5%，高于传统的单纯回流提取和水浴加热提取的提取率。此外微波辅助回流法快速、操作成本低，可减少原料预处理费，且对环境无害。

为进一步纯化小檗碱，本研究还利用AB－8大孔吸附树脂对川黄连中的小檗碱进行分离纯化，得到最佳分离纯化条件为:小檗碱上样量为8.7 mg/mL湿树脂，用3 BV蒸馏水洗脱杂质，再用3 BV的70%的乙醇解吸小檗碱，整个分离纯化过程，控制体积流量为1.0 mL/min。在此纯化工艺下，川黄连醇提液分离纯化前后干固物中小檗碱的纯度从19.3%提高到73.2%，回收率达91.3%。本纯化工艺，操作更简单，在不需要调节pH值条件下，对小檗碱的分离纯化效果更好。另外，由于大孔树脂可反复利用，成本较低，生产周期较短，适宜大规模生产。

因此，本研究工作将有望应用于盐酸小檗碱的提取工业中，为黄连资源的工业化应用起到一定的促进作用。

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