忻 雅，阮松林，马华升，王淑珍，方献平，肖文斐，吴根良

(杭州市农业科学研究院，浙江 杭州 310024)

草莓有“水果皇后”之美誉，不仅有独特的口味还有较高的营养价值。我国是草莓的主要生产国，种植面积和产量位居世界前列。随着社会的进步、技术的发展，仅依靠简单遗传模式的传统草莓育种技术已不能完全满足市场对草莓色、香、味、营养、安全等方面的要求，而这一需求可能随着分子生物学在动植物新品种选育及改良上的广泛应用逐渐得到解决。但栽培草莓(凤梨草莓，Fragaria ananassa Duch.)为高度杂合的八倍体，与其它园艺植物如番茄、葡萄、柑橘相比，草莓基因组学和生理生化方面的研究极其缺乏，极少数报道提供了部分基因序列，但没有揭示关键过程的分子机制，所以有关草莓分子生物学方面的研究远远不能满足其育种需求[1]。

目前，我国生产上主栽品种多引自国外，近年来随着栽培品种数量增加、不同地区之间频繁引种以及草莓本身的营养繁殖特性，使得品种名称十分混乱。这对草莓栽培品种的鉴定提出了更高要求，以前主要是利用形态标记鉴定草莓品种，而20世纪90年代发展起来的分子标记比形态标记具有多方面的优越性。日本有通过DNA鉴定技术保护本国草莓的方法[2]，其他国家较多的运用RAPD标记进行草莓品种鉴定[3-5]，国内最近的报道是用AFLP标记进行草莓品种的遗传关系分析[6]，利用GISH和RAPD进行种间杂种的检测[7]，利用RAPD和SCAR标记对32份草莓材料进行鉴定[8]。但研究表明RAPD标记对实验条件敏感，可重复性较差，为此，国外已开始把稳定高效的SSR标记应用于草莓品种鉴定[9-10]，而国内鲜有这方面的报道。本文利用已有的各种分子标记对南方现有草莓品种资源进行彻查，筛选高效标记构建指纹图谱并进行亲缘关系分析，以便为快速准确鉴定草莓品种提供技术支撑，对自有品种进行有效保护，同时显著加快杂交育种的进程。

1 材料与方法

1.1 材料

17个南方主栽品种(表1)中除了红实美、石莓四号和03-6-2为我国培育品种，其它都为国外引进品种。其中红颊、丰香和章姬来自杭州市农科院草莓圃，其他14个均由浙江省农科院蒋桂华老师提供。为比较各品种间的亲缘关系，本文也同时对杭州市农科院引进的9个德国品种进行了比较研究。取新鲜嫩叶用液氮迅速冷冻处理，然后保存在-80℃冰箱中备用。草莓叶片总DNA提取采用改进的CTAB 法[11]。

1.2 方法

1.2.1 引物合成 参考文献设计了8个RAPD引物[8]、6对SCAR引物[8]和10对 EST-SSR 引物[9]，分别编号为R1～8、S1～6和E1～10，由上海生工生物技术公司合成。

1.2.2 PCR扩增和产物检测 PCR扩增在MG96+型PCR仪上进行，反应体系及反应程序同样参考上述参考文献[8-9]。RAPD、SCAR引物扩增以DNA marker DL2000为分子量标记，EST-SSR引物扩增以GeneRuler 100 bp作为分子量标记，分别用15 g/L琼脂糖凝胶和8.0%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳后进行常规银染。在Bio-Rad凝胶成像系统Gel Doc XR和Bio-Rad GS-800扫描仪上成相。

1.3 数据分析

选取带型稳定、主带明显、影子带少、多态性信息含量较大的引物，确定为构建指纹图谱的核心标记引物。利用人工方法读数，将每个核心标记引物扩增的各个等位点主带型按迁移率由快到慢的顺序编号，按主带型的有无分别记为1、0，由核心标记引物扩增的主带型记录结果组合表示品种的指纹图谱。利用软件NTSYS-pc估算相似系数，采用UPGMA分析程序，绘制亲缘关系树状图。

2 结果与分析

2.1 标记多态性分析

图1 RAPD标记对13个草莓品种的多态性扩增Fig.1 Amplification products obtained from isolates using marker R6 in 13 cultivars.

24个引物对地域来源不同的Tenira与红颊DNA模板进行PCR扩增试验，取能扩增出产物的引物对所有26个DNA进行扩增，分析其多态性。结果，24个引物中，除了引物S4和S5，有22个能对Tenira与红颊基因组DNA扩增出产物，引物可用率达到91.7%。除了引物R1、R2、R5和E1，其余18个引物表现出多态性，多态性引物占可用引物的81.8%。图1、2、3 分别为 RAPD 引物 R6、SCAR 引物(S1、S3)、EST-SSR 引物(E2、E3、E4、E7、E8)对不同草莓品种的多态性扩增。

图2 SCAR标记对26个草莓品种的多态性扩增Fig.2 Amplification products obtained from isolates using SCAR markers in 26 cultivars.

图3 EST-SSR标记对26个草莓品种的多态性扩增Fig.3 Amplification products obtained from isolates using EST-SSR markers in 26 cultivars.

2.2 草莓指纹图谱的建立

上图中除RAPD引物外的其它7对引物带型稳定、多态性信息含量相对较大，被确定为构建指纹图谱的核心标记引物。根据核心引物的扩增情况，对它们在26个品种中扩增的多态性带型进行总结，标记 A-G 分别有4、11、5、7、4、2、2 种带型(图4)。

图4 7个核心标记在26个品种中扩增的多态性带型Fig.4 Polymorphic band types obtained from isolates using 7 core markers in 26 cultivars

根据扩增及计算结果，26个品种的指纹图谱见表1。由表1可知，7个标记的引物扩增带型能形成Gento、Tenira、Rimona、aroma、bellarosse、Kletter、Ferma、佐贺清香、宝交早生、童子一号、法兰第、花姬、红实美、章姬、红颊、丰香、千禧、枥乙女、石莓四号、03-6-2和海玉这21个品种的特异指纹图谱，使它们相互区分。作为自有品种的03-6-2，如果在今后进行大面积推广应用，完全可以用指纹图谱进行品种保护。

由表1还可看出，达塞、弗吉尼亚和鬼怒甘，Elvira和Stugarta的指纹图谱相同，这7个标记引物扩增的带型组合仍然不能使它们相互区分。

表1 26份草莓资源的名称、来源和特征指纹代码Tab.1 Name ，origin and fingerprinting code of 26 strawberry Germplasm

2.3 亲缘关系分析

将每个核心标记引物扩增带型的1、0数据，制成Excel文件用于聚类分析。使用NTSYS-pc软件估算相似系数，采用UPGMA分析程序，绘制亲缘关系树状图(图5)。

图5 26个草莓品种的分子标记聚类图Fig.5 Dendrogram of 26 strawberry cultivars

由图5可以看出，26个草莓品种在相似系数0.63处可以分为4个主要类群，南方主栽引进品种为一个类群(除Gento)，德国品种分3个类群。从相似系数表看出，8个德国品种中亲缘关系最远的是aroma和bellarosse为0.32，最近的是Elvira和Stugarta为1，平均相似系数为0.58。南方主栽引进品种相似系数最远的是03-6-2分别与丰香和海玉为0.59，最近的是达塞和弗吉尼亚和鬼怒甘为1，平均相似系数为0.79，远高于德国引进品种的平均相似系数。这说明南方主栽引进品种的亲缘关系较近，主要原因可能是日本草莓品种杂交亲本重叠较多，比如，章姬为红实美、红颊的亲本之一，宝交早生为石莓四号的亲本之一，杂交种与亲本的相似系数都高达0.86，女峰为章姬的亲本之一，而鬼怒甘从女峰变异株中选出，相似系数高达0.96。弗吉尼亚为红实美的亲本之一，它们的相似系数为0.82。而达塞、弗吉尼亚与章姬，花姬与红颊，红实美与枥乙女，佐贺清香与童子一号，它们的相似系数也都达到了0.96，其遗传关系因为某些品种的亲本来源不明而不甚清楚。Elvira和Stugarta不能区分，达塞、弗吉尼亚和鬼怒甘不能区分，它们极有可能是同种异名的草莓品种。千禧与枥乙女为同种异名的品种，但实验结果它们的相似系数为0.86而非1。这些都有待于进一步的研究，比如材料的进一步确定和标记数目的增加等。其它品种在一定相似水平上可以相互区分，此结果与指纹图谱结果完全吻合。

有些品种虽然不属于同一个地区，但是亲缘关系却很近，如Gento与南方主栽引进品种的亲缘关系比它与德国品种更近，与03-6-2达到了0.86。相反，有些品种虽然属于同一地区，但是亲缘关系却很远，如同为日本品种的佐贺清香与鬼怒甘，宝交早生、章姬与千禧，丰香、海玉与红颊，相似系数只为0.68。造成这种现象的原因有很多，比如频繁的异地引种、品种之间具有共同的亲本、生长条件和自然选择条件相仿等，可能由上述一种或多种因素共同作用而致。

3 讨论

常规的草莓品种鉴定经常通过外观形态观察来进行，往往鉴定周期长，误差较大，一些性状差异小的品种更是难以鉴定。我国南方主栽的草莓品种多引自国外，特别在近几年草莓种植业飞速发展的背景下，引种的力度更是增强。这也导致目前某些引进品种存在同种异名的现象，造成引进和品种利用时严重的人力物力浪费。DNA分子标记反映的是遗传本质上的差异，用于品种鉴定时具有周期短，不受环境条件的影响，真实可靠等优点。本文首次利用分子标记构建了红颊、章姬、丰香等14个南方优质主栽品种和7个德国新引进品种的指纹图谱，使它们完全区分。并对26个草莓品种亲缘关系分析，为目前已经趋于混乱的南方引进和主栽草莓品种的鉴定提供有效的技术支撑。随着品种数量的进一步增加，这7个引物组合的鉴别能力会逐渐减低，但可以根据实际检测情况增加引物组合的数量。此外，利用分子标记技术确定作为亲本的品种间的遗传距离，指导杂交育种亲本选配，为提高育种效率提供理论依据。

本文所用的RAPD标记一直得不到稳定扩增结果，可靠性较差，决定了它不适合用于指纹图谱的构建。扩增结果较稳定的EST-SSR标记和SCAR标记成了本研究的主要工具，但本文所用引物来源于已开发的标记，数量较少，而且多态性极高的标记更少。本文没有区分出的鬼怒甘和弗吉尼亚品种，利用AFLP标记进行分析[6]，虽然亲缘关系非常接近，但还是能区分出来。因此说明本文所用的SSR标记数目不够多，而目前常用的从公共数据库EST序列中筛选并建立EST-SSR标记的技术，为本研究的进一步深入提供了快速经济的有效方法。

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