宋广梅 王虹

【摘 要】从江苏油田的原油和四种不同来源的土壤中，用三种不同的培养液筛选得到41株细菌。对具有较强降解能力细菌的其中8株菌进行测序鉴定，初步确定属于芽孢杆菌属、短波单胞菌属、假单胞菌属、食碱杆菌属及无色杆菌属。

【关键词】石油；降解；细菌

石油及其加工品进入土壤，造成土壤的石油污染。微生物修复具有处理效果好，污染物残留量低，不产生二次污染，对环境影响很小，能够保持或改善植物生长的土壤环境等优点[1]。向污染土壤中投加环境适应性强、降解效能高的菌种或菌群是提高石油类污染物降解效率的重要手段[2]。

1.材料与方法

1.1菌种来源

（1）土样：江苏真武石油基地。①132#磕头机（久置未用）旁表层土；②185#磕头机（长期使用）旁表层土；③磕头机附近草地草根土；④计量站旁表层油污土。

（2）原油：江苏真武石油基地。

1.2富集培养基

（1）无机盐培养液（g/L）：NaNO32，K2HPO41，K2HPO4·3H2O0.5，NaCl0.5，MgSO4·7H2O0.1，CaCl20.01，FeSO4·7H2O0.01PH=7，石油烃（原油：柴油体积比1：4）1%

（2）牛肉膏蛋白胨培养液（g/L）：牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl5，PH=7，石油烃0.5%

（3）牛肉膏蛋白胨培养液，石油烃0.5%，表面活性剂50mg/L

1.3石油中细菌的培养分离

牛肉膏蛋白胨培养基冷却后，加入1%的原油混匀，倒平板。恒温培养箱中30℃静置培养。待平板长出菌落后选择不同颜色及形态的单菌落，划线纯化，将纯化菌株于试管斜面培养后于冰箱4℃保存。三个重复。

1.4土壤中石油烃降解菌的筛选

称取10g土样加入到装有100mL富集培养液的三角瓶中。30℃振荡培养7天。静置30min，取10mL上清夜转接入新鲜培养液中。重复上述步骤连续富集培养5次。

富集培养后，取菌液1mL梯度稀释成10-6、10-7、10-8，取三种不同稀释度菌液0.1mL涂布于分离培养基平板上，28℃恒温培养；待平板长出菌落后选择不同颜色及形态的单菌落，划线纯化，将纯化菌株于试管斜面培养后于冰箱4℃保存。三个重复。

1.5分离菌株的石油烃降解率测定

将所得菌株制成菌悬液（1.1～1.4×108个/ml），取1ml转接入10ml加了1%石油烃的无机盐培养液中，28℃摇床培养7d后，用重量法[3，4]测定降解率。以不接菌的培养基作对照。

1.6高效石油降解菌鉴定

1.6.1菌株DNA提取

选取降解率较高（大于40%）的纯菌株，30℃振荡培养过夜。取1ml培养液到Eppendorf管中，离心，8000r/min，5min，弃去上清液，倒扣Eppendorf管在干滤纸上，空干溶液。将菌体重新悬浮于50μL 超纯水，置旋涡混合器上旋转混匀3s。将Eppendorf管放在沸水浴中煮10min。取出Eppendorf管冰浴10min。如此反复冻融三次，冷却后迅速离心，12000r/min 8min。取上清液，-20℃保存备用 。

1.6.2菌株16SrDNA的PCR扩增

以DNA为模板，引物27F：5`-AGAGTTTGATC CTGGCTCAG-3`和1492R：5`-GGTTACCTTGTTACGACTT-3`；TACGACTT-3；总反应体系为50μL，10×Buffer 5μL，25mmol/L MgCl24μL，2.5mmol/LdNTP 4μL，反向引物与正向引物各1μL，Taq酶0.25μL （5U/μL），模板DNA 2.5μL，ddH2O补足至50μL；PCR反应条件为：94℃预变性2min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃继续延伸10min，4℃保存。

1.6.3菌株测序

扩增成功后，产物送上海生物工程有限公司进行测序。测序后，用Sequence Scanner v1.0软件进行序列分析，将有效序列到NCBI用Blast进行对比。

2.结果与分析

2.1细菌分离结果

从原油和不同培养时间土壤样品中总筛选到41株细菌，其中石油中筛选出2株，土壤中39株。

2.2降解率测定结果

对筛选得到的41株细菌，测定其对石油烃的降解率，降解率最低1%，降解率高于40%的有12株，菌株编号为5、10、13、14、17、21、23、28、47、48、49、51，降解率分别为54.4%、61.8%、63.2%、69.5%、57.4%、47.9%、44.1%、45.6%、77.9%、63.2%、76.5%，其中5#菌来源于原油。

2.3石油降解菌株的鉴定

将降解率大于40%的12株细菌送上海生物工程公司测序，其中21、47、48、49这4株菌扩增失败未测序。其余8株16SrDNA序列测定结果用SequenceScannerv1.0软件进行序列分析与GenBank中已发表的16SrDNA序列进行同源性比较，初步鉴定5#属于芽孢杆菌属（Lysinibacillussp.），10#属于短波单胞菌属（Brevundimonassp.），13#、17#、23#、28#属于假单胞菌属（Pseudomonassp.），14#属于食碱杆菌属（Alcanivoraxsp.），51#属于无色杆菌属（Achromobactersp.）。

3.结论

目前研究报道，能以烃类为唯一碳源和能源生长的微生物在自然界分布广泛，约有70个属（其中细菌28个属，真菌30个属），200多个种[5]。本研究从江苏扬州真武石油污染土壤中分离得到41株能利用石油的细菌，为石油污染土壤的微生物修复提供了新菌种资源；同时对其中降解率较高菌株进行了初步鉴定，确定菌属。

【参考文献】

[1]Aatry AR，Euis GM.Bioremediation：An effective remedied alternative for petroleum hydrocarbon contaminated soil[J].Environ.Prog，1992，11：312-318.

[2]袁红莉，杨金水，王占生.降解石油微生物菌种的筛选及降解特性[J].中国环境科学，2003，23（2）：157-161.

[3]谢丹平，尹华，彭辉，等.混合菌对石油的降解[J].应用与环境生物学报，2004，10（2）：210-214.

[4]污染源统一检测分析方法编写组.污染源统一检测分析方法（废水部分）[M].技术标准出版社，1983，135-136.

[5]丁克强，孙铁珩，李培军.石油污染土壤的生物修复技术[J].生态学杂志，2000，19（2）：50-5.