廖 于，李照东，左的于，刘 宇，晏 勇，左国庆

（1.重庆医药高等专科学校 401331；2重庆医科大学第二临床学院 400010；3重庆医科大学第一临床学院 400016；4.重庆市中医院 400021）

索拉非尼是世界上第一个新型多靶向性的抗肿瘤的口服药物，绝大部分患者对其应答效果好，症状缓解率高，不良反应小［1］。本实验进一步验证索拉非尼在体外引起肝癌细胞凋亡，并测定Mcl－1及bFGF－2的表达，探讨髓样细胞白血病－1蛋白质（Mcl－1）、人碱性成纤维细胞生长因子－2（bFGF－2）在肝癌细胞凋亡过程中表达变化的意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 索拉菲尼购于德国拜耳制药（每粒200mg），CCK－8试剂盒购于江苏碧云天生物技术研究所，AnnexinV－EGFP凋亡试剂盒购于上海贝博生物公司，人bFGF－2ELISA试剂盒购于武汉博士德生物公司，鼠抗人 Mcl－1多克隆抗体购于美国Santa Cruz，人肝癌细胞株HepG2保存于重庆医科大学肝病研究所。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人肝癌细胞株HepG2细胞培养于10%灭活小牛血清的RPMI 1640培养基中（含有1%的双抗），置于37℃，5%CO2培养箱中培养。细胞为贴壁生长，每1～2天换液，2～3d传代，取对数生长期细胞用于实验。

1.2.2 索拉菲尼溶液的制备 用少量100%的二甲亚砜（DMSO）完全溶解索拉菲尼，用1640培养基稀释到所需浓度备用，使DMSO的最终浓度低于0.5%。

1.2.3 CCK－8试剂盒检测药物对肿瘤细胞增殖的影响 将对数生长期细胞常规消化后按5×103／孔接种于96孔板，培养12h后加入药物。实验分组及相关浓度参照文献［2］定为索拉菲尼1.5、3.0、6.0μmol／L组，每组设3个复孔，另设对照组。每孔所加不同浓度药物对应的量均为20μL，加入培养基使每孔的最终体积为200μL。分别作用24、36、48、60、72h后每孔加入20μL CCK－8，37℃下作用1h，酶标仪测定各孔在450nm处的吸光度值（A450）。细胞生存率（%）＝处理组A值／对照组A值×100%。

1.2.4 流式细胞仪分析法测定细胞凋亡 以5×104／孔接种HepG2细胞于6孔板，待细胞贴壁后加入处理因素，60h后收集细胞，离心5min，去掉上清液，冷PBS轻柔冲洗1次，加入400μL缓冲液，加入10μL的Annexin V，避光于孵箱中孵化5min，再加入5μL的PI继续孵化10min，上机检测。

1.2.5 ELISA检测细胞培养液中的bFGF－2表达情况 改用高糖无血清DMEM培养基培养细胞，于细胞对数期加入相应处理因素，继续培养60h后提取各组细胞培养液。按照试剂盒说明依次操作，终止反应后，酶标仪测定A450，绘制bFGF－2浓度水平标准曲线。

1.2.6 Western－blot法检测细胞中 Mcl－1的表达情况 取对数生长期细胞加入处理因素，60h后消化细胞，4℃、1 000 r／min离心5min收集细胞，加入细胞裂解液冰上裂解25min，提取总蛋白质，BCA比色法测定蛋白浓度，SDS－PAGE电泳（每孔上样25μL）后经转膜封闭1h，4℃一抗孵育过夜，在摇床上洗膜3到4次，加二抗常温孵育1h，再次洗膜3次后用ECL发光法显示成像。

1.3 统计学处理 采用SPSS17.0软件进行统计学分析，计量资料以表示，采用单因素方差分析：两两比较，假定方差齐性LSD（L），以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 CCK－8检测肝癌细胞抑制率结果 与对照组抑制率相比，索拉非尼各浓度组（1.5、3.0、6.0μmol／L）均能有效抑制肝癌细胞增殖，呈一定的时间－量效关系（F＝438.841，P＜0.05）。各用药组约在60h到达平台期。见图1。

图1 细胞生长抑制曲线

图2 对照组的流式细胞分析

2.2 流式细胞仪检测肝癌细胞凋亡结果 索拉非尼各浓度组（由低到高）诱导细胞早期凋亡率分别为（14.23±3.12）%，（35.28±3.98）%，（60.32±4.11）%，对照组早期凋亡率为（6.12±2.36）%。各组相比，高浓度的索拉非尼组更能诱导肝癌细胞凋亡（F＝1 404.051，P＜0.05），见图2～5。

图3 索拉菲尼1.5μmol／L组的流式细胞分析

图4 索拉非尼3.0μmol／L组的流式细胞分析

图5 索拉非尼6.0μmol／L组的流式细胞分析

图6 各组Mcl－1蛋白质表达情况（Western blot）

2.3 各组细胞培养液中bFGF－2表达情况 对照组（252.85±5.32）pg／mL，索拉非尼1.5μmol／L组（190.13±6.88）pg／mL，索拉非尼3.0μmol／L组（130.36±4.45）pg／mL，索拉非尼6.0μmol／L组（45.31±4.19）pg／mL。各用药组与对照组相比有统计学意义（P＜0.05），高浓度组效果优于低浓度组（F＝7 534.523，P＜0.05）。

2.4 各组Mcl－1蛋白质表达情况 在免疫印迹带上，与对照组相比，高浓度的索拉非尼组的 Mcl－1表达明显减少，而低浓度的索拉非尼组的Mcl－1减少相对较少。

3 讨 论

本实验结果表明，索拉非尼能导致肝癌细胞凋亡，差异有统计学意义（P＜0.05），其机制主要是在带有致癌的K－ras和b－raf的突变体肿瘤细胞内，索拉非尼能够抑制丝裂酶原活化蛋白激酶（MAPK）的传导通路，从而干扰细胞周期［3］。同时，它阻断Raf／MEK／ERK通路介导的信号传导，还可以抑制多种受体酪氨酸激酶，包括新生血管有关的血管内皮生长因子受体（VEGFR－2、VEGFR－3）、血小板衍生生长因子受体、肿瘤生长相关的干细胞因子受体（C－kit）以及Fms样酪氨酸激酶3（FIt－3）等［4］。而新近文献报道 Mcl－1也是索拉非尼的靶点之一，其主要作用为诱导肝癌细胞凋亡［5］。Mcl－1是B细胞淋巴瘤／白血病－2基因（bcl－2）家族的一员，它的主要作用为促进细胞生存，抑制细胞凋亡［6］，且在肝癌组织的表达显著高于癌旁组织，并与肿瘤大小，分级无关［7］。有学者认为bcl－2家族的高表达也是引起肝癌对常规抗肿瘤药物易产生耐药的主要原因之一，所以，索拉非尼下调 Mcl－1在对于多药物联合抑制肝癌方面有着更深远的意义［8］。

bFGF－2属于拥有广泛促细胞分裂作用的bFGF家族。它们参与一系列生理过程，包括胚胎发育、细胞增殖、组织修复、肿瘤生长和浸润［9－10］。在促进肿瘤生长方面的机制主要是由于bFGF作为一种细胞有丝分裂原和促血管生成因子，可直接作用于肿瘤细胞，使其分泌各种蛋白分解酶和胶原酶，从而促进肿瘤转移和浸润；另外，对活动期肿瘤，它明显促进肿瘤血管的形成，并且通过肿瘤毛细血管内皮增殖，增加肿瘤血液供应，促进肿瘤细胞分裂［11－12］。bFGFS／bFGFRS信号转导与肿瘤发生关系密切，多种肿瘤细胞过量表达bFGFR1和abFGF／bFGF，以bFGFR1和aFGF／bFGF过量表达为特征的自分泌信号环路是肿瘤恶性增生的首要条件［13－14］。临床上，原发性肝癌患者服用索拉非尼后，血清bFGF－2表达明显减少［15］，这与体外实验结果相吻合。

综上，索拉非尼能够诱导肝癌细胞凋亡，并伴有 Mcl－1和bFGF－2表达下调。结合本实验结果及相关文献，提示 Mcl－1与bFGF－2在肿瘤细胞的增殖、分化及凋亡过程中具有十分重要的作用，这对进一步揭示肝癌发生机制，发现新的肝癌诊断标志物及治疗靶点均有重要意义。

［1］ Llovet JM，Ricci S，Mazzaferro V，et al.Sorafenib in advanced hepatocellular carcinoma［J］.N Engl J Med，2008，359（4）：378－390.

［2］ 张华，罗荣城，伍靖，等.索拉非尼联合三氧化二砷对肝癌细胞株 HepG2的作用［J］.广东医学，2008，29（4）：552－555.

［3］ Wilhelm SM，Carter C，Tang L，et al.BAY 43－9006exhibits broad spectrum oral antitumor activity and targets the RAF／MEK／ERK pathway and receptor tyrosine kinases involved in tumor progression and angiogenesis ［J］.Cancer Res，2004，64（19）：7099－7109.

［4］ Liu L，Cao Y，Chen C，et al.Sorafenib blocks the RAF／MEK／ERK pathway，inhibits tumor angiogenesis，and induces tumor cell apoptosis in hepatocellular carcinoma model PLC／PRF／5［J］.Cancer Res，2006，66（24）：11851－11858.

［5］ Zhou C，Liu J，Li Y，et al.microRNA－1274a，a modulator of sorafenib induced a disintegrin and metalloproteinase 9（ADAM9）down－regulation in hepatocellular carcinoma［J］.FEBS Lett，2011，585（12）：1828－1834.

［6］ Liu H，Peng HW，Cheng YS，et al.Stabilization and enhancement of the antiapoptotic activity of mcl－1by TCTP［J］.Mol Cell Biol，2005，25（8）：3117－3126.

［7］ Fleischer B，Schulze－Bergkamen H，Schuchmann M，et al.Mcl－1is an anti－apoptotic factor for human hepatocellular carcinoma［J］.Int J Oncol，2006，28（1）：25－32.

［8］ Sieghart W，Losert D，Strommer S，et al.Mcl－1overexpression in hepatocellular carcinoma：apotential target for antisense therapy［J］.J Hepatol，2006，44（1）：151－157.

［9］ Yamazaki K，Nagao T，Yamaguchi T，et al.Expression of basic fibroblast growth factor（bFGF－2）－associated with tumor proliferation in human pancreatic carcinoma ［J］.Virchows Arch，1997，431（2）：95－101.

［10］Obermair A，Speiser P，Reisenberger K，et al.Influence of intratumoral basic fibroblast growth factor concentration on survival in ovarian cancer patients［J］.Cancer Lett，1998，130（1／2）：69－76.

［11］Park JI，Lee MG，Cho K，et al.Transforming growth factor－beta1activates interleukin－6expression in prostate cancer cells through the synergistic collaboration of the Smad2，p38－NF－kappaB，JNK，and Ras signaling pathways［J］.Oncogene，2003，22（28）：4314－4332.

［12］Hori A，Sasada R，Matsutani E，et al.Suppression of solid tumor growth by immunoneutralizing monoclonal antibody against human basic fibroblast growth factor［J］.Cancer Res，1991，51（22）：6180－6184.

［13］Zhang B，Cao H，Rao GN.Fibroblast growth factor－2is a downstream mediator of phosphatidylinositol 3－kinase－Akt signaling in 14，15－epoxyeicosatrienoic acid－induced angiogenesis［J］.J Biol Chem，2006，281（2）：905－914.

［14］Jee SH，Chu CY，Chiu HC，et al.Interleukin－6induced basic fibroblast growth factor－dependent angiogenesis in basal cell carcinoma cell line via JAK／STAT3and PI3－kinase／Akt pathways ［J］.J Invest Dermatol，2004，123（6）：1169－1175.

［15］丁苇，朱陈，付守忠，等.原发性肝癌患者服用索拉非尼前后血清bFGF浓度变化［J］.齐齐哈尔医学院学报，2010，31（18）：2899.