细胞生物学“半开放设计性实验”教学的意义与实施方法

2013-08-15薛雅蓉刘常宏

实验技术与管理 2013年8期

薛雅蓉，刘常宏

（南京大学生命科学学院，江苏南京 210093）

细胞是组成几乎所有生命有机体（除了病毒）的基本功能单位，要研究生物则避不开细胞。因此，与细胞相关的研究一直是生命科学领域的热门课题，也是诺贝尔生理学或医学奖青睐的研究领域，仅本世纪开始的12年时间里，就有5年颁发给了细胞生物学研究领域的相关学者。这些研究包括：2002年悉尼·布雷内（Sydney Brenner）、罗伯特·霍维茨（H.Robert Horvitz）和约翰·苏尔斯顿（John E.Sulston）的细胞程序性死亡相关研究；2006年克雷格·梅洛（Craig C.Mello）和安德鲁·菲尔（Andrew Fire）的RNA干扰；2009年伊丽莎白 H.布莱克本（Elizabeth H.Blackburn）、卡罗尔 W.葛莱德尔（Carol W.Greider）和杰克 W.卓斯塔克（Jack W.Szostak）的端粒及端粒酶相关研究；2011年基斯·波特（Keith Porter）电子显微镜的应用及超薄切片机的发明；2012年山中伸弥（Shinya Yamanaka）关于诱导多功能干细胞（iPScell）的研究。

由于细胞研究的重要性，开设有生物相关学科（生命科学、医学、药学、农学等）的各个高校对于细胞生物学理论及实验课程都很重视，一般作为本科生的核心必修课程，这也决定了该课程在培养生命科学人才中的重要作用。细胞生物学实验课程不但要培养学生掌握独特的细胞生物学实验方法、原理与技术，还要在实验过程中提高学生的细胞生物学综合实验素质与创新实验能力。要完成这样艰巨的任务，实验指导教师在实验教学中不但应根据学科发展对实验教学内容不断地进行更新，还应不断探索和改进实验教学方法。

1 细胞生物学实验教学方法现状及存在问题

1.1 常规教学的作用及问题

截至目前，细胞生物学实验教学方法主要为常规实验教学方法，即由教师提供经前人反复验证、方法可行、结果可靠的实验方法，并在实验前详细讲解实验背景知识、用途、原理、操作关键点及意义、注意事项等。学生被要求完全按照教师的方法进行实验，然后教师根据学生实验结果及报告等评价、考核学生［1－2］。

常规教学的作用是：

（1）在每次3～4h的教学时间段内能够完成实验且得到符合预期的实验结果。

（2）能够规范学生的实验操作，培养学生严谨认真的实验态度。由于学生必须按照教师的方法及操作完成实验才能得到预期的实验结果，就使其认识到，实验是严肃认真的事情，不能马虎大意，否则就有可能得不到预期结果。

（3）树立学生实验信心。学生只要按实验步骤正常操作就会得到预期结果，会给学生树立起前人能做的自己也可以做的实验信心。

但常规教学也有一些不可避免的弊端。由于学生实验时动手多而动脑少，必然养成依赖于已有方法的习惯，导致学生自主学习积极性下降甚至丧失，懒于思考，继而思维僵化，严重时可能扼杀学生的批判性及创造性思维能力。

1.2 开放设计实验的意义及实施的困难

为了弥补常规实验教学的不足，一些高校的实验课教师探索在教学实践中增加开放设计性实验［3－6］。一般由教师指定选题范围，然后让学生选题并设计实验方法，最后在开放实验室于正常教学时间之外实施设计实验［3，5，7］。开放设计实验项目一般具有4个特征［8］：学生学习的自主性，实验内容的探索性，实验技能的综合性，实验精神的创造性。因此，开展此类实验能够克服常规实验教学的一些弊端，调动学生自主学习积极性、提高学生自主学习及运用所学知识分析解决实验问题的能力及实验综合素质与创新实验能力。

然而，完全的开放设计性实验往往存在实施困难的问题［9］。原因主要有3条：

（1）实验硬件条件的限制。不同方法要求的实验条件不同，没有哪个实验室具备开展所有方法实验的条件。比如，细胞融合的方法有电融合法、病毒介导法、PEG介导法。电融合法需要电融合仪，病毒介导法需要繁殖仙台病毒，不是每个实验室都可以开展这样的工作。再比如，检测细胞增殖能力可用氚标记的胸腺嘧啶核苷（3H－TdR）掺入法，也可用 MTT比色法。前一方法用到同位素，国内大部分教学实验室都不具备开展此类实验的条件。因此，如果让学生随意设计实验方法，有些方法就有可能无法实施。

（2）实验时间的限制。不同方法实施起来可能需要的时间差别很大。如果学生设计的一些方法需要时间过长，超出正常教学安排太多，就无法在正常教学有限时间内进行。比如，如果让学生设计细胞培养实验，有的学生会设计植物细胞原生质体的分离与培养，那么，由于原生质体制备时酶解需要时间较长，就难以在正常实验时间开设。

（3）实验教学成本预算的限制。不同实验方法成本差别很大，对于一些严重超出额定预算的方法，就难以开展。

因此，需要寻找一种兼顾教学效果和可行性的实验教学方法。这种方法既能在一定程度上实现设计实验的教学效果，又便于在正常教学实验时间实施且结果和成本可控。为此，我们提出了“半开放设计性实验”的概念。下文中，我们将对半开放设计性实验的内涵、实施方法、开展时机等进行论述，并通过2个细胞生物学“半开放设计性实验”教学实例及学生评价进一步说明该法的具体实施方法及优势。

2 半开放设计性实验的内涵、实施方法及实施时机

2.1 半开放设计性实验的内涵

“半开放设计性实验”指让学生在指定的方法内进行实验方法优化设计，并能够在正常实验教学的限定时间内实施的实验。由于它无论在内容选择方面还是在实施时间方面都有限制，不及一般开放设计实验的开放程度，因此，我们将其称为半开放设计性实验。

2.2 半开放设计性实验实施方法

实验前2～3周，教师布置半开放设计性实验的内容及设计要求、实施时间及考核方法，建议学生自由组合成4人小组，以组为单位进行资料查阅与分析、实验方案讨论与确定、实验准备及实施。实验前1周，学生应以组为单位开出实验需要的仪器设备及试剂清单；实验时学生分工合作，完成所有设计内容；实验结束后，同组学生共享实验结果，并经过分析和讨论提出实验结论，汇总实验报告。教师通过批阅学生实验报告对学生设计的合理性及实验分析进行点评指导。

2.3 半开放设计实验的开展时机

半开放设计性实验项目最好安排在学期后期，在学生做过一些精心挑选的细胞生物学代表性、经典性实验，掌握了基本的细胞生物学实验方法原理和技术，并对理论课内容有很好的理解后进行。这样学生设计实验方法时对实验的难度及可行性会有一个比较切合实际的评估，并且对实验实施需要时间也会有一个较好的掌控。

3 细胞生物学半开放设计实验实例

3.1 PEG介导的细胞融合实验

细胞融合（cell fusion）又称为细胞杂交（cell hybridization），是指2个或2个以上的细胞合并成一个细胞的现象。通过细胞融合可以将2个亲本细胞的遗传物质集中在一个后代细胞里，有可能使后代细胞获得2个亲本细胞的优良性状。如单克隆抗体生产中通过细胞融合获得的杂交瘤细胞，就同时兼备小鼠成熟B细胞能够分泌特定抗体的特性和小鼠骨髓瘤细胞能够在体外长期存活的特性。直至目前，细胞融合技术在细胞工程领域仍然发挥着重要作用，除了用于研制生产单克隆抗体外，还用于培育植物新品种，诱导不同种间、属间，甚至科间原生质体的融合。细胞融合有可能打破有性杂交不亲和性的界限，广泛地组合各种基因型，从而形成有性杂交方法所无法获得的新型杂种植株。

细胞发生自然融合（骨骼肌细胞形成、精卵结合）的机会很少，一般需要在特殊诱导条件存在时才会发生融合。其中一种最为常用的方法就是PEG介导的化学融合法。

PEG即聚乙二醇（polythyleneglycol，PEG），为乙二醇不同分子量的聚合物，可用于诱导动物细胞和植物原生质体融合。用PEG介导融合相对于电融合和病毒介导融合的优点是材料易得而价廉、操作简单、效果可靠［10－11］。但是我们在实验教学实践中发现，PEG介导细胞融合的效果常常不如预期，不是融合率太低，就是细胞破坏（凋亡、坏死、甚至脱核）严重。文献调研发现，细胞种类、用于融合的细胞所处状态、PEG的分子量、融合液中PEG的浓度、是否添加钙离子、PEG作用于细胞的时间长短以及去除PEG作用后细胞温育时间长短，都对最后的观察结果有影响。

为了让学生了解PEG介导细胞融合实验的复杂性，我们将该实验作为半开放设计性实验，让学生在限定条件下对实验方法进行优化。首先，教师提供给学生足够的特定细胞材料（鸡红细胞或小鼠腹水瘤细胞）、不同分子量的PEG以及一个常规实验方法，要求学生通过查阅、分析资料，了解影响融合效率的其他因素及条件，设计优化方案并通过在正常教学时间的实验找到组内相对理想的实验方法。

经过实验，学生了解到：

（1）不同分子量的PEG溶液在相同浓度时黏度不同，对细胞的作用也不同；

（2）PEG浓度过小不能有效介导细胞融合；

（3）PEG作用时间越长，细胞破坏越严重；

（4）将PEG加在细胞悬液中融合效果极差，必须加在离心去掉上清的细胞沉淀中；

（5）钙离子有促融合作用，但应注意使用浓度与添加方法（避免沉淀产生）；

（6）文献资料并非都正确，不能照搬于实验，要多方印证，甄别应用。比如：学生通过查阅文献发现，钙离子有促融合作用，但在具体实验时却发现，多个参考书提供的钙离子浓度都太大，其溶液无法配制；怀疑单位有误，后经查阅多篇发表的科研论文求证，证明其确系单位错误。再比如，一些细胞实验指导中融合实验是将PEG加在细胞悬液中，但经证实效果极差，几乎得不到融合的细胞。

3.2 MTT法检测细胞活力实验

MTT即二甲基噻唑二苯基四唑溴盐。MTT法是Mosmen于1983年率先建立的一种用线粒体酶活性反映细胞增殖与活力的方法。由于其与通过细胞DNA合成反映细胞增殖活性的3H－TdR掺入法相比，具有无放射危险、操作简便而快速的优点，目前已广泛应用于细胞生物学、免疫学等学科的研究以及临床肿瘤细胞的药敏实验。

MTT法的检测原理是：MTT能被各种活细胞（除红细胞外）摄取，在线粒体内被脱氢酶还原，由黄色可溶性溶液转变为不溶性的紫色甲臜（formazan）颗粒沉积在细胞内；甲臜的形成量与活细胞数量及活性成正比，死细胞不形成甲臜。再用细胞裂解液裂解细胞并溶解甲臜后，于波长550～600nm（甲臜有光吸收而MTT无光吸收）测定溶液的吸光值，用以反映细胞的增殖与活力。也就是说，对于同样活力的细胞，活细胞的数量越多，测定的可溶性甲臜的吸光值越大，吸光值与细胞数量成正比。反过来讲，只有吸光值与活细胞数量成正比，才能用吸光值变化反映细胞的增殖活性变化。然而，可溶性甲臜的吸光值并非在任何细胞浓度都与细胞数量成正比。对于特定细胞而言，只有在一定浓度范围内时，甲臜溶液的吸光值大小才与细胞数量成正比，影响细胞增殖（促进或抑制）的因素才会引起吸光值的灵敏变化，不同处理的作用才得以有效显示；若细胞浓度偏离线性检测范围，测定结果就很不规律，不能反映被检因素的实际效果。另外，裂解液组成、作用条件与时间等多种因素都会影响甲臜溶液的吸光值测定结果［12－14］，如果应用不当，则会造成细胞裂解不完全、甲臜溶解不充分而致测定值偏小或不稳定（随时间变化）。

为了让学生充分了解影响MTT法检测效果的因素，我们也将该实验作为半开放设计性实验。提供给学生小鼠腹腔内大量繁殖的S－180细胞（每30人的班只需提供2只接瘤1周的荷瘤小鼠），让学生从细胞浓度、裂解液及作用条件等方面进行设计，找出MTT检测值与细胞浓度呈线性关系的细胞浓度范围以及能够在正常实验课时间充分裂解细胞、溶解甲臜（可用倒置显微镜监测溶解情况）的裂解液及对应裂解条件。

经过实验，学生不仅对上述影响MTT法测定结果的因素有了充分的认识，还了解到细胞计数及稀释准确性、向96孔反应板加细胞前细胞样品是否充分混匀、操作时是否产生气泡等对测定结果的影响。

4 学生对于半开放设计性实验的评价

学期末，我们要求学生写一份“细胞生物学实验总结、评价与建议”，一方面是为了加强学生对本门实验课所学内容的掌握，另一方面是希望了解学生对该课程本学期教学相关情况的评价以及对今后教学的改进建议。总结内容应包括实验过的项目内容、本人从中学习到的知识及技能、获得的经验及教训等。评价及建议主要考虑3个方面：教学内容及安排，教学方法，实验室硬件条件。

从学生总结中了解到，半开放设计性实验受到学生的普遍欢迎，他们对于该类实验的评价是：能够调动自主学习积极性；从某种程度上模拟了科研实验的过程，能够培养科学思维能力及创新意识；能够提高利用所学知识及网络资源分析问题、解决问题的能力；能够强化团队协作意识。因此，学生建议在以后教学中增加这类实验项目的比例。