尚 娜，周志军

（1.河北大学 图书馆，河北 保定 071002；2.河北大学 生命科学学院，河北 保定 071002）

实验教学是理工科高等教育的重要组成部分，是培养高质量科学人才的关键。传统的实验教学依附于理论课，受限于实验学时的安排，由一个个相互孤立的、小而散的实验项目组成。在实验内容方面，以验证性为主，内容陈旧呆板［1］。进入21世纪，许多高校都尝试对实验教学，主要包括实验教学体系、结构、内容进行了改革，构建符合素质教育和人才发展的开放创新实验教学模式［2－4］，一些学者提出将科研成果移植为实验项目，服务于实验教学［5－6］。适时地选择一些科研成果，将其转化为专题实验，使学生能够全程参与一项完整的科研过程，对于培养学生的动手能力、分析解决问题能力和创新能力具有重要意义。

1 科研成果服务生命科学专题实验教学举例

1.1 专题实验内容选择

2003年，加拿大生态学家Herbert等提出DNA条形码概念（DNA Barcoding），针对形态学分类固有的缺陷，如表型可塑性和遗传可变性、无法鉴定隐存分类单元、不同发育阶段的物种、不完整的生物体组织碎片等，Herbert倡导利用线粒体COⅠ基因5′端长度为658bp的标准基因片段在DNA水平上进行物种区分，构建全球性的物种鉴别平台［7－8］。

1.2 实验内容及安排

1.2.1 仪器、试剂与材料

仪器：PCR扩增仪、冷冻高速台式离心机、超净工作台、微量移液器、稳压稳流电泳仪、恒温金属浴等分子生物学实验室常规设备。

试剂：蛋白酶 K、rTaq聚合酶、dNTPs、DNA Marker、DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒、EB（溴化乙锭）、Na2EDTA（乙二铵四乙酸钠盐）、Tris平衡酚、琼脂糖、无水乙醇、氯仿、SDS等。

材料：新鲜标本、酒精浸泡标本或干制针插标本等。

1.2.2 总DNA提取

取标本足股节肌肉，采用酚－氯仿抽提法，参考田英芳等（1999）提出的方法提取总 DNA［9］。具体步骤为：

（1）配制裂解液。A︰B︰C＝8︰1︰1（A液：0.05MTris，0.1MNaCl，0.1MNa2EDTA，pH 7.0～8.0；B液：5%SDS；C液：2mg／mL蛋白酶K）；

（2）编号。要求简单、实验室唯一、有一定的自明性、取材后的凭证标本与提取所使用离心管相对应。

（3）取材。用无菌眼科剪刀剪开后足股节表皮，用镊子夹取适量肌肉组织放入盛有600μL裂解液的离心管中，经剪刀反复剪碎、研磨后，加入1 μLRNA酶。

（4）消化。65℃水浴1～2h，至消化液变清亮。

（5）酚抽提。加入等体积Tris平衡酚，上下缓慢颠倒混匀，8000r／min离心10min，取上清，并重复1次。

（6）氯仿抽提。加入等体积氯仿／异戊醇混合液（24︰1），上下缓慢颠倒混匀，8000r／min离心10 min，取上清。

（7）沉淀DNA。加入2倍体积的冰无水乙醇，在冰箱中放置20min以沉淀DNA，12000r／min离心15min，弃上清；再加入1mL 70%冰乙醇洗涤DNA，12000r／min离心15min，弃上清。

（8）自然干燥后，溶解于50μL无菌双蒸水。

（9）电泳检测。1%琼脂糖凝胶检测，EB染色，紫外成像系统拍照。

1.2.3 PCR扩增

选用DNA条形码通用引物：LCO1490：5’－GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G －3’和HC02198：5’－TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA －3’进行扩增［10］。参考 TaKaRa rTaq聚合酶使用说明，配置反应体系（25μL），其中10×Buffer 2.5μL，dNTPs 2.0μL，模板DNA 3μL，引物各3μL，酶0.25μL，加超纯水补齐。PCR扩增反应的参数为：94℃预变性3min；94℃变性15s，49℃退火20s，70℃延伸90s，35个循环；72℃延伸7min。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行分离，切取目标条带后使用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收后，送测序公司进行直接测序或连接到T载体中进行克隆测序。

1.2.4 数据处理

测序公司提供的测序结果通常是abi格式，双向测序结果经Lasergene 6中的SeqMan软件进行峰图校正和拼接，最终以fasta格式输出［11］。为避免核基因组中Numts干扰，首先使用Lasergene 6中的Editseq软件［11］，选择无脊椎动物线粒体密码子表对序列进行翻译，检测是否存在由于碱基突变、插入／缺失导致的翻译意外终止的Numts；然后使用ClustalX［12］经多重序列比对筛查存在碱基插入／缺失的Numts。最后使用 MEGA 4.0［13］计算序列的碱基组成（nucleotide composition）、变异位点（variable sites）、保守位点（conserved sites）、简约信息位点（parsimony information sites）、自裔位点（singleton sites）、转换与颠换的比例（Ts／Tv）、种内及种间kimura 2－parameter距离等，并采用K2P（kimuras 2parameter）模型，以邻接法（neibor－joining，NJ）构建系统发育关系树。

2 结束语

综上所述，实验教学是高等学校，特别是理工科院校教学的重要组成部分，是提高教学质量、培养具有创新精神和实践能力的高素质人才不可缺少的重要环节。DNA条形码研究实验稳定性、重现性好，具备很好的可操作性，综合性强，适合生命科学专业高年级的实验教学。通过开设DNA条形码研究实验，在实验操作方面，可以使学生充分掌握DNA提取、琼脂糖凝胶电泳、PCR扩增、DNA琼脂糖凝胶回收、PCR产物克隆测序等一系列分子生物学实验技能；在数据处理方面，则可以使学生掌握引物设计、序列校对、拼接与注释、GenBank数据库序列提交、多重序列比对、碱基组成分析、系统发育树重建等一系列分子系统学数据处理方法。这类基于科研成果移植而来的专题实验教学，不但在很大程度上改变了传统教学模式，更为重要的是探索出了一条创新性实验教学的新思路。

（References）

［1］常春耘，陆南.实验教学存在的问题及改革措施［J］.实验室研究与探索，2006，25（2）：235－237，243.

［2］王慧琴，吴庆丰，梁晓军，等.以应用为导向的大学物理实验改革的探讨［J］.实验技术与管理，2012，29（9）：148－150.

［3］邓友娥，颜志森.学术期刊辅助电子技术实验教学探析［J］.实验室研究与探索，2012，31（8）：329－331.

［4］潘涌璋，唐启红，张秋明，等.大学生创新性实验计划项目管理模式探讨［J］.实验技术与管理，2012，29（6）：146－150.

［5］王英华，魏士刚，程新民，等.科研成果移植为化学创新教学实验：分光光度法同时测定混合物中钼、钨含量［J］.实验技术与管理，2007，24（9）：15－16，23.

［6］于兵川，吴洪特，童金强.科研成果转化为实验项目初探［J］.实验室研究与探索，2009，28（1）：133－135.

［7］Hebert P D N，Cywinska A，Ball S L，et al.Biological identifications through DNA barcodes［J］.Proceedings of the Royal Society B：Biological Sciences，2003，270（1512）：313－321.

［8］Hebert P D N，Ratnasingham S，deWaard J R.Barcoding animal life：cytochrome c oxidase subunit 1divergences among closely related species［J］.Proceedings of the Royal Society B：Biological Sciences（Suppl.），2003，270：96－99.

［9］田英芳，黄刚，郑哲民，等.一种简易的昆虫基因组DNA提取方法［J］.陕西师范大学学报：自然科学版，1999，27（4）：82－84.

［10］Folmer O，Black M，Hoeh W，et al.DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates［J］.Mol Mar Biol Biotechnol，1994，3（5）：294－299.

［11］Burland T G.DNASTAR’s Lasergene sequence analysis software［J］.Methods Mol Biol，2000（132）：71－91.

［12］Thompson J D，Gibson T J，Plewniak F，et al.The CLUSTAL＿X windows interface：flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools［J］.Nucleic Acids Res，1997，25（24）：4876－4882.

［13］Tamura K，Dudley J，Nei M，et al.MEGA4：Molecular Evolutionary Genetics Analysis（MEGA）software version 4.0［J］.Mol Biol Evol，2007，24（8）：1596－1599.