魏希颖 ，王家稳，刘清梅，胡妍妍

（陕西师范大学 生命科学学院，陕西 西安710062）

微生物资源的开发利用是继动植物资源之后的第三大生物支柱产业，具有可再生性．其开发利用的基础首先是选育新性状、高产和低能耗等特性的优良菌株，然而直接从自然界中筛选到的原始菌株往往不能满足工业生产的需求，需经过不同的育种方法进行菌种改良以满足生产所需．传统诱变育种技术虽然操作简便、技术成熟，但是存在许多不足之处，如盲目性高、工作量大、效率低等问题．运用现代分子生物学手段对微生物进行定向基因操作，虽然较传统育种取得了一定成果，但是基因型和表型相应背景的欠缺限制了其应用．由此，研究开发高效定向的微生物菌种选育方法一直是微生物科学工作者们所面临的重要课题．

基因组重排（Genome Shuffling）技术是20世纪90年代中期，美国加州Maxgen公司Cardayré等［1］首次提出的，是基于DNA Shuffling的原理［2］，将传统诱变技术和细胞融合技术相结合，以整个基因组作为重组对象的多亲本原生质体递推融合技术．该技术能大幅度提高微生物细胞的正向突变频率及正向突变速度，使得人们能够在较短的时间内获得高效的正向突变的菌株，它是近年发展起来的微生物育种新技术，并被视为是菌株选育和代谢工程上的重大里程碑［3］．

1 基因组重排的建立及其优势

1．1 基因组重排的建立

从20世纪90年代开始，微生物育种学逐渐与代谢工程、化学工程和进化工程相结合而发展起来．90年代初，美国加州Maxygen生物技术公司Cardayré等就萌发DNA重排和基因组重排育种的思路．Stemmer等［2］在1994年率先提出DNA重排技术，该技术是一种体外定向进化分子的方法，在一定程度上模仿生物体自然进化过程中减数分裂期等位基因间的DNA片段交换，首先用DNAaseI将同源的DNA消化成片段，再将得到的随机片段无引物PCR，使之重新随机装配从而获得多种排列组合的突变基因库．

基于相似的原理，Crameri等［4］在1998年将DNA重排技术延伸到DNA家族重排上，它是以来自不同种属的同源基因进行DNA重排操作的技术．该技术打破不同种属间的遗传界限，通过提高亲本基因群中差异的组合频率和重排子代的杂合度，以增加突变文库的多样性，提高突变文库的质量，进而有效地产生满足需要的突变体．

由于生物体中的绝大部分表型受到多个基因协同调控，2002年，Zhang等［1］又进一步提出在细胞水平的基因组重排，该技术模拟自然进化的过程，将诱变育种技术和原生质体融合技术相结合，以分子进化为核心在实验室实现微生物全细胞快速定向进化．首先对出发菌株进行人工诱变，选择目标性状超过出发菌株的正突变体，构成各种变异体组成的突变库，然后将这些带有不同有益基因的多亲本菌株进行多轮递推式原生质体融合，这样通过有性生殖［5－6］或基因重组在全基因范围内交换重组遗传信息来合理利用突变菌库中的基因差异，消除并淘汰有害突变，高效地积累并综合突变库中所有亲本大部分有益变异基因，从而达到跳跃性的人工进化目标，同时获取表型最优的后代．Stemmer等首次将基因组重排技术应用于弗氏链霉菌（Streptomyces fradiae），研究显示仅通过两轮递推式融合所得到的高产菌株就能优于历经20年经过20轮常规诱变所获得的高产菌株；之后Patnaik R等［7］应用该技术提高了乳酸杆菌的耐酸能力和产量．由此可见，基因组重排可有效提高菌株间基因组的重组频率，缩短选育周期，使获得优良突变株的频率得到极大的提高．该技术不仅能改良工业菌株的生产特性，还能为各种各样的微生物提供信息源和复杂的代谢调控网络数据，被证实是一种具有广阔应用前景的新技术［8］．

1．2 基因组重排的优势

基因组重排的基础是诱变技术与原生质体融合技术，它是传统育种技术的发展和延伸．作为一种新型、快速、有效的技术，其与经典的诱变育种、原生质体融合技术相比具有明显的优势．

1．2．1 避免菌株产生“疲劳效应” 传统的育种技术连续的诱变会造成菌株产生“疲劳效应”，而基因组重排过只需经过一次诱变，避免了菌种因长期使用诱变剂而导致的自身抗性增强和产生“疲劳效应”等现象．

1．2．2 快速、高效，省时，设备简单 传统育种技术具有较大的盲目性、随机性、费时、费力，且菌株突变面临回复现象等难题．若需得到具有单一基因正向突变的菌株，传统育种技术至少需要105的变异文库进行筛选，而基因组重排只需经过一次诱变获取微量的正突变株后，通过连续多次的“递推式原生质体融合”，进行多亲本全基因组范围内交换重组遗传信息，就能够快速、高效地积累多亲本全部正向突变特点的子代．该技术操作简单，设备易得，费用低廉，应用前景广阔．

1．2．3 多亲本的基因水平转移 传统的诱变育种实质上是单亲的变异和遗传，需要多次诱变和筛选的繁杂过程，花费漫长的周期，才能实现单一菌株上发生多点有利突变．基因组重排是一种多水平遗传方式，它通过原生质体的递推式融合使基因组发生高效的重组，提高了亲本遗传的多样性，使多重优良性状子代出现的频率更高．同时，由于继承了原生质体融合技术的优点，基因组重排可以实现远源亲本的基因水平转移，为微生物育种提供更加广阔的操作空间．如Zhao等［9］将不同种的轮梗霉和黑曲霉进行融合筛选了高产花生四烯酸（AA）和具有利用广谱碳源的菌株；John等［10］用德式乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii NCIM2025）和淀粉酶产生菌（Bacillus amyloliquefaciensATCC23842）进行融合筛选出了高产L－乳酸的菌株．

1．2．4 子代菌株具有的遗传多样性 基因组重排源于诱变技术和原生质体融合技术，但三者最大区别在于基因组重排使用多亲本、多正向突变菌株和递推式融合，由于DNA重组的随机性，能产生和积累各种各样的正突变组合．因此经重排后的子代菌株间的遗传距离将高于两亲本间的遗传距离，这将增加子代群体内的遗传多样性，从而提高获得优良性状菌株的概率，为进一步改良菌株提供丰富的资源，同时也能为菌株复杂的代谢网络调控提供数据信息．如：El－Gendy等［11］利用RAPD技术对野生菌株、出发菌和融合菌进行遗传多样性分析，结果表明它们之间存在很大的差异；Xu等［12］利用AFLP技术对野生菌、出发菌和融合菌进行遗传多样性分析，同样表明经过诱变和重排后的菌株同野生菌相比存在很大的差异．

1．2．5 产生的子代稳定性与安全性高 由于基因组重排是模拟自然进化的过程，通过原生质体融合将多亲本不同的有益基因融合重组积累正突变基因，同时降低或消除了有害、中性突变．如Stephen B del Cardayré所说：“它原本就是在自然界中实实在在发生的事情，我们只是帮助这些菌株打破了它们之间的界限，加快了它们的遗传物质组合在一起的速度”［1］．因此该技术筛选出的菌株的稳定性更高．相对基因工程菌株而言，该技术是利用生化手段让亲本中优良的基因自然地集中在一起，不存在利用外来基因进行拼接的可能，因此经基因组重排产生的菌株的安全性亦更高．

1．2．6 无须对菌种遗传背景十分清楚，有效地对由“多基因”调控的性状进行改良DNA重组技术、定向进化工程、代谢工程和系统生物学手段等，使人们有可能直接得到理想中的优良性状，在一定程度上达到了定向进化的目的，但这些技术手段都是建立在对目标菌株遗传背景深入了解的基础上，需要花费巨额的费用和较长的时间代价去探索其遗传规律．基因组重排则无须了解微生物生命活动的深层调控机制，它以细胞内整套基因组为对象，可进行随机地交换重组整合，通过筛选最佳的“组合”，加快定向进化的速率，对于“多基因”调控的性状改良效果明显，能够达到快速育种的目的．

2 基因组重排的应用

基因组重排充分结合传统诱变育种和细胞工程的优势，具有快速高效改良工业菌种表型的能力［2，6］，还能为各种各样的微生物提供信息源和复杂的代谢调控网络数据．目前，基因组重排主要应用于提高微生物代谢产物产率，增强菌株对环境的耐受性，提高底物利用率和范围，改变代谢途径产生新的代谢产物等．

2．1 提高产物产率

经过基因组重排后能够有效的优化和调节多基因控制的性状来提高产量．Hida等［13］通过基因组重排，对链霉菌（Streptomyces sp．U121）采用NTG诱变，然后进行3轮原生质体递推融合后筛选到一高产菌株3－61，其产羟甲基柠檬酸的产量比野生菌株提高5倍；El－Gendy等［11］对诺卡氏菌（Nocardia sp．ALAA 2000）采用EMS和UV进行诱变，经过3轮重排后筛选到一株高产绫霉素的融合菌F3／22，其产量比野生菌提高了19倍；Zhang等［14］采用基因组重排对谢曼（氏）丙酸杆菌（Propionibacterium shermanii）进行改造，使其产维生素B12的能力比出发菌株提高61%；Gong等［15］通过基因组重排对纤维堆囊菌（Sorangium cellulosum）进行改造，使抗癌新药埃博霉素B（epothilone B）的产量比野生菌提高了130倍．

2．2 增强菌株对环境的耐受性

目前，基因组重排已经成功应用于提高菌株对酸、盐、底物、温度、产物等因素的耐受性．如通过基因组重排提高菌株对酸的耐受性［7，15，16－17］；啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）耐乙醇和高产乙醇能力［5，6］；Cao等［18－19］分别对鲁氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）和假丝酵母（Candida versatilis）进行基因组重排筛选出具有耐盐和广谱pH的融合菌株；Xu等［12］用基因组重排获得了具有提高产普纳霉素的始旋链霉菌（Streptomyces pristinaespiralis）对普纳霉素的耐受性；Shi等采用基因组重排获取的融合子可以在55℃下正常生长和能耐受25%（V／V）的乙醇［20］．

2．3 提高底物利用率和范围

基因组重排同样适用于提高菌株对底物的利用能力和范围．Burkhard［21］等应用基因组重排筛选到一株更高效利用甘油的菌株，使其产物1，3－丙二醇产量相较原始菌提高80%；Dai等［22］利用基因组重排对Sphingobium chlorophenolicum ATCC39723表型改良，经过3轮基因组重排后，筛选的融合菌比野生菌对五氯苯酚具有更高利用率；Zhao等［9］利用基因组重排对轮梗霉和黑曲霉进行3轮重排，筛选到一株能利用8种碳源和6种氮源的融合菌；Kang等［23］经过3轮递推融合筛选到一株高效利用淀粉水解液达97．9%的融合菌株．

2．4 改造微生物的代谢途径产生新的代谢产物

应用基因组重排还可以改变菌株的代谢途径产生新的代谢产物．Cao等［18］利用基因组重排对鲁氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）进行3轮重排后筛选到一株能高产香味化合物和新化合物 的融合菌株；Wang等［24］对一株产紫杉醇的内生真菌（Tuberculariasp．TF5）用UV和NTG对原生质体诱变建立突变库，经过1轮重排，筛选到一株突变株（M－741）能产生3种新的倍半萜类（Sesquiterpenoids）化合物，另一株重排融合菌（G－444）能产生新的18种其他化合物，其中有10种化合物是在TF5中没有检测到的物质．

3 基因组重排应用存在的问题与展望

3．1 存在问题

基因组重排在应用过程中存在的问题：（1）首先在选择遗传变异足够丰富的突变体进行原生质体递推融合时，正突变基因组文库的筛选和筛选模型的建立存在一定困难；（2）在递推融合过程中原生质体的形成率、再生率、活性及其融合菌株高效、高通量筛选模型的建立限制了基因组重排的广泛应用；（3）基因组重排应用菌种改良过程中，由于基因组片段重组也是随机的并不具备定向性，在积累有益突变时也会产生一些中性和有害突变体，有时甚至丧失固有的优良性状，如何高效、定向的筛选目的表型融合菌存在着一定的困难和挑战；（4）基因组重排目前普遍运用于同种单亲本菌株，对于不同种多亲本细胞之间的报道还是很少，且存在同源性越差，重组频率越低的问题；（5）虽然基因组重排可以快速、高效的改进工业生产菌种或优化代谢途径，但是仅仅通过基因组重排人们很难了解发生改进或优化的原因及分子机制．

3．2 展望

基因组重排利用原有基因进行交换重组，这是在传统育种、原生质体融合以及DNA重排的基础上对微生物育种技术的一次革命性的改进，随着基因组重排的不断成熟，各种普适的高通量、高效快速筛选策略的出现必将促进基因组重排的广泛应用，选育出更加适合工业生产的菌种；同时随着生物信息学、代谢工程、基因工程、功能基因组学等其他生物技术与之相结合，必将揭示基因型和表型的关系以及代谢途径得到优化的分子机制，甚至发现代谢网络中一些未知的调节机制，同时该技术还有可能成为以后新型化合物开发中的一个有力工具．特别是在目前的研究发展中，基因组重排被广泛应用于提高许多新型药用微生物的产量，以满足人们对药物的需求，同时也解决了众多药物资源缺乏的困境．该技术在今后的药物微生物菌种选育和其他工业微生物育种研究过程中将得到进一步的应用和发展．

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