夏海滨， 李 星

（陕西师范大学 生命科学学院，陕西 西安710062）

miRNA是近年来发现的广泛存在于真核生物中的一类长18～26个核苷酸的内源性非编码小分子RNA，可通过与靶mRNA的3′UTRs（Untranslated Regions）近乎完全互补结合，在转录后水平使其降解或者与之不完全互补结合在翻译水平抑制蛋白合成，从而在基因表达中发挥重要的调节作用［1］．miRNA最早是在线虫中观察到的，包括lin－4和let－7［1］基因，线虫的发育由这些基因所调控．随后miRNA被发现在包括从线虫到果蝇以及人的多种组织中存在［2］．目前，已发现6 000多个miRNA，其中包括超过600个人类的miRNA［3］．其中约1／3的蛋白编码基因受miRNA调控［4］．miRNA的主要功能是调节生物体生长、发育和疾病发生过程中有关基因的表达．近来多项研究发现，若干miRNA在各种肿瘤组织中的表达水平有不同程度上调或下调，这一现象表明miRNA在肿瘤细胞中表达水平的异常，是肿瘤发生、发展的重要影响因素．

1 miRNA的生成

miRNA的生成依次在细胞核和细胞质中进行，包括5个重要步骤：在细胞核中，编码miRNA基因在RNA polⅡ （RNA polymeraseⅡ）的作用下，转录出具有茎－环结构的初级miRNA（primiRNA）．Pri－miRNA在RNA聚合酶ⅢDrosha和辅助因子双链RNA可吸附蛋白（Digeorge Syndrome Critical Region gene 8，DGCR8）的联合剪切作用下，形成长度为60～70nt并含有茎环结构的双链RNA，即 前体miRNA（Pre－miRNA）［3］．Pre－miRNA在依赖Ran－GTP的Exportin5作用下从细胞核转运至细胞质中．在细胞质中，RNA转移内切酶Dicer在TRBP和Ago2的协助下识别premiRNA双链的5′末端磷酸基及3′末端突出．Dicer剪切发夹样pre－miRNA形成22bp不完全互补的双链．成熟的miRNA与其互补链结合成双螺旋结构，当双螺旋打开后，其中的一条会与RNA诱导沉默复合物（RNA－induced Silencing Complex，RISC）结合，形成非对称RISC复合体 （Asymmetric RISC Assembly）．该非对称RISC复合物能够与目标靶mRNA相结合［5］．

2 miRNA与肿瘤

近年研究发现约50%已知的miRNAs与多种人类肿瘤相关，表明其在肿瘤发生中具有重要作用．从已证实功能的miRNA来看，它们实际上可作为致癌基因或抑癌基因而发挥作用．据报道有些miRNA在肿瘤中表达是降低的，包括let－7、miR－15a／miR－16－1、miR－34、miR－10、miR－125、miR－143／miR－145等．有些miRNA在肿瘤中的表达是升高的，包括miR－17－92、miR－20、miR－21、miR－155等．下面将介绍至今研究较为深入的与肿瘤发生发展相关的miRNA．

2．1 let－7

let－7最早在线虫中发现，它能够调控细胞的分化和增殖的时序．研究发现let－7基因家族的表达水平在肺癌、卵巢癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞中显著下调，而且肺癌和乳腺癌中let－7a的表达水平与患者的生存时间呈正相关［6］．let－7家族编码的miRNA是第一个被发现的可以调节表达原癌基因RAS蛋白的miRNA．Johnson等在线虫中利用RNA干扰技术，发现let－7能负调控其靶蛋白RAS［7］．此后Kumar等［8］通过实验证实let－7可直接调控c－Myc的表达，并且发现let－7可与其靶基因RAS和c－Myc互补配对而下调RAS、c－Myc的表达，抑制其翻译过程．目前研究已证实let－7miRNA表达谱在肿瘤细胞与正常细胞中存在明显差异，因此let－7 miRNA在肿瘤早期诊断方面可能有重要意义．Guled的研究表明，在恶性间皮瘤中，let－7b的表达呈上调趋势，与此同时let－7e的表达量则进行下调［9］．这提示let－7基因家族成员在同一细胞中具有不同的潜在的分化调节作用．

2．2 miR－15a／miR－16－1

研究发现miR－15和miR－16位于慢性淋巴白血病（Chronic Lymphocytic Leukemia，CLL）患者中易丢失的约30kb染色体片段中．在约50%的外套细胞淋巴瘤（Mantle Cell Lymphoma）、16%～40%的多发性骨髓瘤（Multiple Myeloma）和60%的前列腺癌（Prostate Carcinoma）中可检测到这样的缺失区［10］．提示在染色体13q14基因区域至少存在一种或多种肿瘤抑制基因．Cimmino等发现在约65%的CLL患者中miR－15a和miR－16－1发生缺失或表达下调［11］，与此同时BCL－2基因则呈过表达，miR－15a和miR－16－1的表达水平和BCL－2蛋白表达水平呈明显负相关．BCL－2蛋白在细胞凋亡中起着关键作用，因此推测miR－15a和miR－16－1的缺失或下调可能会导致BCL－2表达增强，从而导致肿瘤的发生．

2．3 miR－34a／b／c

在哺乳动物中发现miR－34家族包含3个miRNAs，分别是miR－34a、miR－34b和miR－34c．其中miR－34a定位于1p36上，而miR－34b和miR－34c共同分享一个转录本，定位于染色体11q23上［12］．在小鼠研究中发现，miR－34a在脑部呈高表达，而miR－34b／c则在肺组织中呈高表达．Tazawa等研究发现，在36%的直肠癌和73%的前列腺癌中miR－34a的表达水平下调，在43%的非小细胞型肺癌中miR－34b发生下调．并且当miR－34a的活性被抑制后，p53诱发的细胞凋亡率大幅下调，而过表达miR－34a的肿瘤细胞的成瘤能力明显降低［13］．这些miRNA的异常表达同时下调多种细胞周期调节蛋白，导致细胞周期阻滞［12］．因此，恢复miR－34的功能将被视为一条治疗肿瘤的有效途径．

2．4 miR－143／miR－145

miR－143和miR－145定位于染色体5q32－33D的脆性位点处［14］．在乳腺癌、前列腺癌、宫颈癌、淋巴系统肿瘤及大肠癌细胞等肿瘤细胞中miR－143和miR－145表达下调［15］．目前尚未发现miR－143和miR－145确定作用的靶基因，而潜在的基因包括有：信号传导途径中的基因，如Raf、RICS、G－protein γ7、HGK；基因表达的染色质调控基因，如M96A，SMARCF1；蛋白质转录和代谢过程的基因，如ATP1A1、GOLGA2、SMS、TMOD1、NUDT5、PAH、DHFR和MTHFR；处理加工RNA和蛋白质的基因，如HNRPC、TXNDC4、ERP44等［15］．Chen等发现miR－143是通过抑制KRAS的翻译来抑制结肠癌增殖的［16］．但 是Kulda［17］认为miR－143在癌变细胞中的作用是非常复杂的，目前还难以确定miR－143究竟是抑癌或是致癌miRNA．

2．5 miR－155

miR－155定位于人染色体21q21，位于BIC基因241～262位之间［14］．与TS－miRs（Tumor Supressor－miRNAs）不同的是，致癌miRNA通常在肿瘤中表达上调，并表现出增殖或抗凋亡活性．miR－155属于最早被鉴定的致癌microRNA之一，它与非蛋白编码基因BIC共表达．miR－155可以通过影响细胞因子的生成从而调节T辅助细胞的分化［18］，同时Rodriguez等［19］发现bic／mir－155能够通过调节淋巴和树突细胞的功能引起免疫应答缺陷．Lee等研究发现在霍奇金淋巴瘤（HL）、原发性纵隔B细胞淋巴瘤（PMBL）中BIC的表达与miR－155的水平一致，提示BIC可能为miR－155的前体［14］．通常，在被激活的B细胞、T细胞和单核细胞中miR－155都有较高水平的表达［20］．Tam等曾在淋巴细胞瘤模型中验证BIC编码的mRNA能与c－Myc相互作用促进细胞增殖，并参与淋巴瘤的发生和发展，推断BIC与c－Myc之间的相互作用是通过miR－155来实现的．因此，miR－155可能是作为癌基因与c－Myc协同发挥作用［21］．

2．6 miR－21

具有原癌基因活性的miR－21位于染色体的脆性区域17q23．2，它在大多数癌细胞中的表达均有上调［3］．已有的研究结果显示，miR－21能够促进肿瘤细胞生长并同时抑制细胞凋亡．miR－21可以直接靶向PTEN使其下调，从而导致肿瘤细胞凋亡率明显下降．此外，miR－21也可靶向于一种促凋亡基因PDCD4［22］．通常miR－21在HCC中的表达是上调的，而PDCD4在肝癌细胞（HCC）中则是下调的．这表明miR－21可以同时通过靶向PTEN和PDCD4来抑制凋亡．近来研究表明，miR－21还可靶向于其他重要的肿瘤抑制基因，包括TPM1和SERPINB5［23］，提示miR－21也有可能在促进肿瘤侵袭和迁移中扮演重要的角色．

2．7 miR－17－92

与miR－21一样，miR－17－92是另一种在癌组织中高表达的miRNAs．miR－17家族包括7种miRNA：miR－17－5p，miR－17－3p，miR－18，miR－19a，miR－19b－1，miR－20以及miR－92－1［24］．miR－17家族位于人类染色体13q31上C13orf25基因初级转录本的第3个内含子区．miR－17－92表达簇所在的13q31．3在多种类型淋巴瘤及实体瘤中经常发生片段的扩增．He等［24］发现过表达的miR－17－92与c－Myc可共同诱导鼠B细胞淋巴瘤的生成及肿瘤组织中凋亡细胞的比例降低；而在单独过表达c－Myc所诱发的淋巴瘤模型中，其组织中细胞凋亡的比例增加，表明miR－17－92可能具有阻断c－myc诱导凋亡作用的功能．此外，O′Donnell等［25］发现，这些miRNAs在转录水平受到c－Myc的调控，在多细胞模型中，诱导c－Myc的表达可以增加miR－17的水平．他的研究进一步发现转录因子E2F1是miR－17和miR－20的靶基因．E2F1既能通过激活DNA合成期的S期基因加速细胞增殖，也能通过ARF－P53途径加速细胞凋亡．这些研究表明，miR－17－92家族主要是通过抑制抑癌基因和细胞周期调控基因的表达来诱导肿瘤的发生．

3 miRNA与肿瘤诊断

同正常细胞相比，某些miRNA在肿瘤组织及细胞中呈现高表达，因此miRNA有潜力成为肿瘤新的标记，并有可能成为肿瘤诊断、预后的生物标记物．RT－PCR、Northern－blot和microarray是研究这一方面的有力工具．Lee等［26］通过原位RT－PCR技术在胰腺细胞中发现miR－221、miR－376a和miR－301有异常表达，而在基质细胞、良性的胰腺腺泡或腺管中则未出现异常．Yanaihara等［27］发现hsamiR－155高表达和hsa－let－7a－2低表达与肺肿瘤的预后不良有关．Lu等［28］根据微珠流式细胞术建立的miRNAs表达图谱，对肿瘤组织和正常组织的miRNAs表达谱进行了比较，发现不同肿瘤类型间的miRNAs的表达谱存在一定差异．利用miRNAs表达谱的不同对不同组织来源的肿瘤进行单独聚类．来源于上皮细胞的肿瘤如结肠癌、肝癌、胰腺癌和胃癌等可以归为一类，显示出miRNAs表达谱有助于人类肿瘤的组织分型．另外Lu等认为，miRNAs可能会在决定细胞分化状态方面起到进一步的作用，将肿瘤组织的miRNAs表达谱与正常组织相比可确定这些细胞的分化程度．因此建立肿瘤miRNA标签或miRNA表达谱，将有助于对癌症的诊断与治疗．

4 miRNA与肿瘤的基因治疗

miRNA作为肿瘤抑制基因对于肿瘤的治疗具有很大的影响．在肿瘤中，针对某些特定的miRNA的表达进行干预可控制肿瘤的相关过程如细胞分化、增殖和凋亡等．近年来应用miRNA治疗肿瘤主要有两个策略．一种策略是针对在肿瘤组织中下调的miRNA，导入相应外源的miRNA以提升其表达，可抑制肿瘤细胞的增殖和／或诱导其凋亡，如通过补充与天然miRNA序列相同的小分子可增强miRNA的 作 用．Takamizawa等［29］将 合成 的let－7补充到let－7低表达的肺腺癌细胞株A549中，抑制RAS蛋白的翻译，肿瘤细胞的生长明显受到抑制．这种方法与siRNA相比，由于前者来源于细胞基因组中，其序列相对固定，并且体内存在miNRA表达的调控机制，并由组织特异性启动子所控制，而siRNA由于是人工设计合成的一段小干扰RNA，使用siRNA进行基因治疗则会使机体产生较大的免疫反应．另一种策略是应用反义技术抑制上调的miRNA．人们直接将化学合成的针对成熟miRNA序列的反义寡核苷酸（AMOs）用于肿瘤的治疗研究．He等［24］发现，在转基因小鼠体内表达mir－17－92能够有效抑制c－myc诱导的细胞凋亡，从而加快肿瘤形成．而Krutzfeldt［30］等开发出一组拮抗miRNA的药物，小鼠尾静脉注射拮抗miR－16、miR－122、miR－192和miR－194的抗miRNA寡核 苷 酸（antagomirs）会导致小鼠肝、肺、肾、心、小肠、脂肪、皮肤、骨髓、肌肉、卵巢和肾上腺等组织中相应的miRNA明显减少．这种方法比其他抗肿瘤药物更为稳定且毒性小，可以有效的控制miRNA在各个器官中的活性．

5 miRNA的前景展望

目前miRNAs在动物生长发育、细胞增殖、分化、凋亡及基因调控中的作用，引发了人们对miRNAs与肿瘤形成之间关系的思考．无疑抑癌与致癌miRNAs的发现将成为癌症研究的新热点．近年来人类对miRNA的认识已取得很大进展，大量新的miRNA被发现，对miRNA作用机制和一些基因的功能有了较为全面的认识，并且已经开始进行miRNA在肿瘤等人类疾病的诊断和治疗方面的探索．miRNA作为细胞网络调控表达中的关键因子，影响着多条信号传导通路．通常一个miRNA可以影响多个靶基因，而一个靶基因又可受多个miRNA的调控．然而有关miRNA的研究还有许多难点，如miRNA存在时空表达特异性，不同类型肿瘤、同一类型肿瘤的不同阶段其miRNA表达均存在高度时空特异性．再比如miRNA是通过什么信号转导方式与靶基因的mRNA的3＇端结合，并影响其翻译功能．因此揭示miRNA的作用机制对于人们认识体内miRNA之间、miRNA与mRNA之间、miRNA与蛋白质以及与DNA之间的网络交互作用具有重要的意义．相信不久的将来，miRNA研究一定会有突破性进展，从而推动miRNA在肿瘤基因治疗领域中的广泛应用．

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