贾丽

真菌是一种真核细胞型微生物。种类繁多，有10万多种，多数对人类有益无害。少数为单细胞，大多数为多细胞，细胞结构比较完整，有细胞壁与典型细胞核。真菌比细菌大几倍甚至几十倍，用普通光学显微镜的低倍或高倍镜就能看见。真菌的繁殖方式通常分为有性繁殖和无性繁殖两类［1］。致病性真菌多是无性繁殖还有的真菌可通过菌丝体的断裂片段产生新个体，实验室“转管”接种正是利用这一特点来繁殖菌种的。

1 标本的采集及运送

不同真菌感染应采用不同的临床标本。浅部真菌感染可以采集毛发、皮屑、指(趾)甲、痂等，标本在分离前常先用75%的乙醇消毒。深部真菌感染的检查可取痰、尿液、口腔或阴道分泌物、脑脊液、各种穿刺液和活检组织等。采集标本时应注意无菌操作。采集标本后应及时转运至实验室进行检查，一般不超过1～2 h，以免标本变质污染。标本须在用药前采集，对已用药者则需停药一段时间后再采集标本。所有用于真菌学检验的标本，均需用无菌容器送检。应在用药前采取标本。如已用药，则应停药后再采取标本。

2 方法

2.1 直接检查法 直接镜检是最简单也是很有价值的实验室诊断方法。其优点在于简便、快速，无菌部位的阳性结果可直接确定真菌感染。但是，除了少数真菌外，多数不能确定其种类。由于阳性率较低，阴性结果亦不能排除诊断，有时需反复检查或做其他方法检查以进一步确定。直接镜检对于浅表和皮下真菌感染最有帮助。不染色标本检查取皮屑、毛发、指(趾)甲屑等标本置于载玻片中央，滴加100～200 g/L KOH溶液1～2滴，以盖玻片覆盖后在火焰上微微加热，使组织或角质溶解、透明后，先于低倍镜检查有无真菌菌丝或孢子，再以高倍镜检查其特征，可初步诊断真菌感染。

2.2 染色标本检查 有些真菌如深部真菌需要染色后才能更清楚地观察，常用的染色方法有革兰染色法所有真菌均为革兰阳性。乳酸酚棉蓝染色法取标本于载玻片上，滴加染液，加上盖玻片后于镜下观察，真菌被染成蓝色。该法适用于各种真菌的直接检查，培养物涂片检查及小培养标本保存等。荧光染色法用0.1%吖啶橙对标本涂片和组织切片进行染色，在荧光显微镜下观察，白假丝酵母菌、皮炎芽生菌、球孢子菌为黄绿色，新型隐球菌、鼻孢子菌为红色，组织胞浆菌为红黄色，曲霉菌为绿色。

2.3 分离培养法 真菌培养是目前鉴定真菌的唯一方法。其培养方法有多种，根据需要选用最适合的方法。在不同的培养基上真菌菌落形态变化很大，一般以沙保弱(SDA)培养基为基准描写菌落的形态。常用的培养基有无选择性培养基、选择性培养基和鉴别培养基。平皿培养法是将培养基倾注于平皿，然后将皮屑、甲屑、毛发标本经70%乙醇浸泡2～3 min以杀死杂菌，无菌盐水洗净后接种于沙保弱培养基上，置25℃ ～28℃培养数日至数周，观察菌落特征;其他标本接种于血平板或沙保弱培养基上37℃培养。此法的优点是便于分离并观察菌落特征，但水分易蒸发。试管培养法为实验室中最常用的一种方法，一般用于菌种传代接种与保存［2］。在大口径试管中装入培养基，制成斜面。接种方便、不易污染。小培养法是观察真菌结构特征及生长发育全过程的有效方法。取无菌“V”形玻棒(或浸泡乙醇，干后)放入无菌平皿内;取无菌载玻片(或浸泡乙醇，干后)放在玻棒上;制备1 cm2马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)于载玻片上;在琼脂块的每一侧用接种针接种待检菌;⑤取灼烧后的盖玻片盖在琼脂块上，平皿内放少许无菌蒸馏水，加盖，置于25℃ ～28℃孵育(白假丝酵母菌培养24～48 h，而皮肤癣真菌培养1～7 d);⑥培养后，弃琼脂块于消毒液中，滴加乳酸酚棉蓝染液于载玻片上，再将取下的盖玻片置于载玻片上染色镜检。

3 讨论

真菌是易发生变异的一类微生物，在培养基上多次人工传代或培养时间过久，其形态结构、菌落性状、色素甚至毒力都可发生改变。真菌对干燥、阳光、紫外线及一般消毒剂有较强的抵抗力。但不耐热，60℃加热1 h菌丝和孢子均被杀死。对真菌致病性研究仅限于少数几种真菌。不同的真菌可通过下列五种形式致病:致病性真菌感染、条件致病性真菌感染、真菌超敏反应性疾病、真菌性中毒症、真菌毒素与肿瘤的关系。临床表现，真菌形态学、免疫学和病理学。最直接的方法是能证明真菌存在于组织中，或在渗出物中可分离培养。病理组织学的改变只有少数病变具有特征性。

［1］秦启贤，秦立摸，章强强.临床真菌学.上海:复旦大学出版社，2001.

［2］李春阳，刘方，郭淑兰，等.医院内真菌感染的调查分析临床皮肤科杂志，2002，31(2):121-122.