胡有谷 陈伯华

（青岛大学医学院附属医院脊柱外科山东省创伤骨科研究所，青岛266003）

椎间盘退变是导致腰背痛的病理生理学原因之一。多年来，对椎间盘细胞、生化特性以及微环境的研究，发现椎间盘退变时呈现细胞凋亡、细胞数减少、重要的细胞外基质蛋白多糖和Ⅱ型胶原降低和基质金属蛋白酶活性增加等。因此，20世纪90年代后期许多学者开始研究新的治疗方法，即椎间盘退变的生物学治疗。生物学治疗包括细胞治疗、基因治疗和椎间盘组织工程。当前以基因治疗最具期待用于椎间盘退变的临床治疗方法。

基因治疗基于将外源性基因DNA或RNA转染至靶细胞，引起外源基因表达并对靶细胞降低或缺乏的有利的蛋白质合成,恢复靶细胞的正常功能和形态7年日本Nishida[1]首先开展了椎间盘退变基因治疗实验研究。山东省创伤骨科研究所自1999年至今进行椎间盘退变基因治疗研究工作。椎间盘退变基因治疗实验研究程序为靶细胞的确定、目的基因的选择、载体的选择、基因的表达以及转基因后生物学效应的验证。

椎间盘退变基因治疗10余年的研究结果显示：①髓核中软骨细胞可选作为靶细胞，而纤维环中纤维细胞在正向调控基因作用下并不能增加细胞外基质。②确定某些外源性生长因子基因转染的表达，可上调合成细胞外基质。例如TGF家族，其中TGF-β1和TGF-β3在体内、外试验中均能有效增加细胞外基质蛋白多糖和Ⅱ型胶原的表达。③腺病毒和腺相关病毒为最有效的转染基因载体，可将转染的目的基因片段导入到靶细胞，达到目的基因与靶细胞的整合，使基因片段循环表达并在原位一定时期合成目的蛋白。腺相关病毒它能转染至多种组织细胞，对人类无致病性和很轻微的免疫反应并使目的基因较长期表达。④观察椎间盘基因治疗体内试验效果，以灵长类动物恒河猴椎间盘退变模型评价基因转染后生物学效应为宜。经过10余年上述研究证实，基因治疗可能成为一种延缓和逆转的有效方法。然而，椎间盘退变基因治疗尚存在期望转染目的基因长期表达的要求,目前体内试验示椎间盘内蛋白多糖和Ⅱ型胶原的含量增加能持续达26周。此外，病毒类载体的安全性尚待确定和基因表达的调控等尚待解决。因此由实验研究进入到临床应用尚有距离。

在上述椎间盘退变基因治疗取得成绩的基础上，该课题己成为脊柱外科基础研究重点之一。依据近年来国内、外相关文献和本所研究的工作，在椎间盘退变基因治疗又取得以下新的进展。

1 目的基因的应用趋向

1.1 细胞因子的选择

用于椎间盘退变基因治疗的细胞因子分为4类：①抗分解代谢细胞因子，如基质金属蛋白酶抑制剂（TIMPs）和白细胞介素l（interleukin，IL-I）受体拮抗剂[4,5]。②促细胞分裂素，如胰岛素生长因子（insulin-like growth factor-1,IGF-1）、生长分化因子5（growth and differential factor 5，GDF-5）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和结缔组织生长因子（connective tissue growth factor,CTGF）等[6-9]。③骨诱导形成素，如转化生长因子（transforming growth factor-beta,TGF-β家族）和骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP家族）[2,10]。④细胞内调节因子如骨诱导蛋白I（LIM mineralization protein-l，LMP-1）和 Sox-9 基 因[11,12]。上述细胞因子基因被用于正向调控的目的基因。

上述4类细胞因子为椎间盘退变基因治疗所选1991年Thompson[2]首先证实外源性（TGF-β1）能上调狗的椎间盘组织培养中的蛋白多糖合成。1999年Nishida[2]首先开展椎间盘退变基因治疗，体内动物模型退变椎间盘证实应用TGF-β能增加细胞外基质蛋白多糖合成7年Moon[3]首先体外基因转染人椎间盘细胞。用的目的基因,目前尚无新入选的细胞因子。各类细胞因子对细胞外基质影响不同[15]。TGF-β对蛋白多糖和Ⅱ型胶原均能发挥上调作用[13,14]，SOX9为转换因子，其增加Ⅱ型胶原表达，体外试验能增加人椎间盘髓核细胞中重要细胞外基质Ⅱ型胶原含量[15]。

1.2 多细胞因子基因转染

双细胞因子基因转染：在2004年以前为单细胞因子目的基因应用7年后从事多细胞因子基因转染。本研究所2004年后进行了双细胞因子转染退变椎间盘TGF-β1和VEGF，TGF-β1和TGF-β3。另为其中一为正向调控细胞因子TGF-β1和另一为MMP抑制因子TIMP-1。双正向调控细胞因子转染退变椎间盘后生物学效应优于单细胞因子转染的效果[16,17]。VEGF和TIMP-1能协助TGF-β家族上调椎间盘中基质合成和代谢的平衡，但VEGF不能增加髓核细胞的基质合成[18]。Leckie等[19]报导应用AAV-BMP2和TIMP1体内试验显示能延缓椎间盘退变。Haschtmann等[20]报告双细胞因子作用的不同结果，其基因治疗体内试验发现BMP-2和TGF-β3不能阻止椎间盘退变。这表明TGF-β家族和BMP家族中不同的分子结构蛋白质对退变椎间盘髓核细胞呈现不同的作用。

三细胞因子基因转染：2008年Moon和Nishida[22]提出基因治疗多细胞因子转染，又称为鸡尾酒式治疗性基因转染（cocktail therapeutic gene transfer）。体外试验以腺病毒为载体转染TGF-β1 gene（Ad/TGF-β 1），IGF-1 gene（Ad/IGF-1）BMP-2 gene(Ad/BMP-2)。18 h后测定细胞蛋白多糖含量。其结果上述3个细胞因子的单细胞因子转染的蛋白多糖含量较对照组增高分别为 Ad/TGF-β 2.91倍，Ad/IGF-1 1.8倍，Ad/BMP-2 1.9倍。双细胞因子转染的蛋白多糖含量较对照组增高3.2～3.9倍。三细胞因子转染的蛋白多糖含量较对照组增高4.7倍。此显示三细胞因子转染均较单细胞因子转染和双细胞因子转染后蛋白多糖含量为髙。此种多细胞因子基因转染方法可减少腺病毒用量，并防止全身和局部毒性作用和免疫反应[21]。

本研究所2011年选用hTGF-β3、CTGF 和TIMP-1三细胞因子基因体外转染,其结果显示三细胞因子转染较双细胞因子转染后细胞外基质蛋白多糖含量增高1.5倍。

1.3 协助细胞因子上调功能

除应用细胞因子调控主要的细胞基质外,亦可用合成肽Link N协助细胞因子增强上调功能。体内实验显示注入Link N后，在髓核和纤维环内聚集蛋白多糖基因表达明显增加，而蛋白酶基因表达明显下降，但不改变间盘DNA含量[22]。

细胞因子与细胞治疗结合：以移植细胞为基础的基因转染（cell-based gene delivery），此适用于严重椎间盘退变。移植细胞携帶治疗性细胞因子，此较转基因方法安全。Zhang等[23]体外试验髓核细胞与软骨细胞共同培养,后者过度表达的BMPs可刺激蛋白多糖和胶原的产生。

2 病毒类载体应用进展

细胞的目的基因转染需要通过载体,裸露的目的基因DNA不能被细胞所结合和表达，因而不能将目的基因直接导入细胞内。目的基因需要通过载体包装，转入、保护和携带基因序列至靶细胞，随后获得目的基因的表达。外源性基因真核表达载体分为非病毒类（naked deoxyribonucleic acid）和病毒类，前者非病毒类载体PCI己不应用，后者病毒类载体包括逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒应用较多[24]。总之，通过载体的选择由非病毒类至逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒的进程，其结果增强了目的基因感染细胞的成功率和加强了基因表达。但由于此类病毒的携带细胞因子目的基因容量有限、目的基因表达时间短和转基因后的生物学效应随时间延长而下降，因而探寻新的基因转染载体。

近年来其他疾病如神经系统退行性疾病和血液病等基因治疗，应用慢病毒载体作为新的病毒类载体[25,26]。

2.1 慢病毒（lentiviral veccttoorr，LLVV）

慢病毒染色体组的载体其特点为可用于各种组织的靶细胞、能承载更多的基因载荷，可携带较大基因组、可将目的基因高效整合至基因组DNA而稳定表达。可高效感染分裂期及非分裂期细胞，亦利于靶细胞的基因表达调节。慢病毒整合宿主细胞的染色质，而不是优先整合于转切起始部位的近端,而发生易于插入基因表达富染色体区。慢病毒载体具有不易诱发宿主免疫反应，从安全角度来说，能尽量减少RCV的产生，为复制缺陷型病毒载体，不会对细胞或人体产生不良污染，属于低毒性病毒载体。慢病毒安全性明显优于逆转录病毒，亦优于非病毒类基因载体[27-29]。慢病毒载体用于转基因技术与传统的DNA显微注射相比具有操作简单、整合效率高、成本低廉等。基于这些优点，以其作为基因转染体系的转基因研究，在近年来得到了广泛的开展。慢病毒染色体组的载体在8年前己用于临床试验和转基因动物。慢病毒载体现己在动物模型中成功地用于治疗各种基因缺陷性疾病和生理性疾病。临床应用前的研究结果显示人类基因治疗可应用慢病毒载体的证据[30]。

当前应用的慢病毒主要为HIV，2008年诺贝尔生理和医学奖授于3位研究人乳头状病毒和HIV病毒临床科学家。Françoise Barré-Sinouss和Luc Montagnier为研究HIV作出贡献。尽管对HIV己经研究25年，但是至今尚无有效预防和治疗效果的抗病毒疫苗。因而，感染HIV的艾滋病（acquired immunodeficiency syndrome,AIDS）仍然临床无法治愈。然而对HIV结构和生物学的了解和以HIV为载体的经各种标准化的技术测定，证实其安全性己有很大的进步。己认为HIV病毒可作为安全性的转基因载体，且较其它病毒类载体和非病毒类载体更适于转染非分化、分化缓慢和静止期的细胞。本研究所成功地分别应用慢病毒HIV构建人生存素survivin、TGF-b3 TIMP-1和慢病毒hTGF-β3、CTGF和TIMP-1构建质粒转染椎间盘[31]。

2.2 杆状病毒（Baculovirus）

文献中亦有报告杆状病毒作为载体。杆状病毒为一昆虫病毒，在体内或体外能释放外源性基因至哺乳类动物细胞，包括不含细胞毒素末分化细胞。Liu等[32]报告杆状病毒携带绿色莹光蛋白（the green fluorescence protein gene，Ad-CMV-GFP），注入髓核内，用莹光显微镜和流式细胞仪检测基因表达.结果发现87%髓核细胞感染并证实。长期基因表达对细胞无毒性反应。

3 基因治疗新策略——基因表达调控

3.1 RNA干扰技术（RNA interference，RNAi）

最近认为RNAi技术能在椎间盘内下调某些特殊基因表达，尤其是病理性基因表达调节，此为椎间盘基因治疗开创了新的途径,成为椎间盘退变基因治疗另一策略[33]。RNAi是一种在转录水平高效阻抑基因表达的新方法，它通过导入一段与内源性基因同源的双链RNA序列（dsRNA），使内源mRNA降解，从而达到阻止目的基因表达的目的[34]。RNAi干扰技术降低由小干扰RNA（siRNA）产生的靶基因产物，siRNA与靶基因的mRNA的特异序列结合，此既可抑制mRNA的翻译又可增强mRNA的降解。因此，可将椎间盘组织细胞内分解代谢基因作为靶基因并通过siRNA介导破坏，使分解代谢基因沉默阻止分解代谢基因翻译。当siRNA与治疗性外源性基因结合时，其半衰期短。RNAi基因沉默和其他传统方法相比的特点[35]：①高特异。最显著特征是只引起与dsRNA同源的mRNA降解，而其他mRNA的表达不受影响。②高效性。显著抑制基因表达甚至完全敲除每个细胞只需要几个siRNA就能有效抑制靶基因表达。③可传播性。siRNA具有强烈的跨越细胞界限的能力，能够在不同细胞间长距离传递和维持，RNAi扩散到整个机体并可传代。④可遗传性。RNAi的基因沉默在低等动物中可遗传。

近年来RNAi成功用于动物构建转基因椎间盘退变模型。Kakutani等[36]体外椎间盘细胞和体内椎间盘转染含有两种荧光素酶基因的质粒和针对Firefly基因的siRNA以及针对细胞Fas蛋白配体的siRNA分子及非特异性siRNA分子。结果显示体外实验由siRNA介导的基因在小鼠髓核细胞中下调94.7%，在人髓核细胞中下调93.7%,体内试验特异性的基因沉默持续超过24周，而对照的基因表达未受影响。证实用DNA载体-siRNA复合物可获得特殊靶基因表达的下调。Seki等[37]发现在退变椎间盘中存在蛋白溶解酶如金属蛋白酶和ADAMTS家族（去整合素和含有血小板凝血酶样的金属蛋白酶的基因）。其在动物退变椎间盘模型中单次注射ADAMTS-5 siRNA和寡核苷酸，观察椎间盘高度、MRI和椎间盘组织番红-O染色、证实ADAMTS-5 siRNA可抑制髓核降解。此种椎间盘退变组织对siRNA反应的机制可能具有治疗价值。此外，Sudo等[38]报告用caspase 3 siRNA转染髓核可明显降低细胞凋亡，保存正常细胞外基质。因此，RNAi机理适合于对椎间盘退变的MMPs和ILs细胞外基质降解基因发挥基因沉默的作用，从而延缓或阻断椎间盘退变。

3.2 基因表达系统调控

置入基因表达系统有热休克蛋白（heat shock proteins,hsp）、金属流基组氨酸基内盐（metallothionine）、激素调节启动子（steroid regulatory promoters）、四环素和昆虫蜕皮激素受体（insect ecdysone receptor）等方法。多数置入基因表达系统在载体结构内与治疗基因活性标志区相连，使基因表达“开”和“关”。热休克蛋白基因的表达受温度变化的影响。编码hsp70基因的表达是在hsp70B启动子的控制之下。该启动子可与导人体内的靶基因结合，通过提高局部温度促进靶基因的表达。Tet-On系统为转基因表达系统在注入四环素后与AAV载体结构结合。此系统己成功地显示标记基因的调节[39,40]。

4 椎间盘退变动物模型建立和观察

椎间盘退变基因治疗体内实验是为获得过渡到临床应用的必备条件。其中椎间盘退变动物模型所选择的动物己公认为灵长类动物。退变椎间盘造模方法尚无确切的生理性椎盘退变方法，而目前通用的造模方法为椎间盘针刺损伤法。此法因穿剌针直径不同而致椎间盘退变出现的时间和严重度不一。本研究所取恒河猴在CT引导下应用20号针经皮穿剌椎间盘进行退变椎间盘造模,获得了早期椎间盘退变并延长了观察时间[41]。

椎间盘退变基因治疗体内实验研究需观察生物学效应。退变椎间盘转目的基因后，应定期作退变椎间盘和自身对照椎间盘兼或对照组退变椎间盘的Ⅱ型胶原和蛋白聚糖生物化学测定。为了取椎间盘组织，通常以动物处死方式，这使得动物用量增加和長期随访观察受限。

当前MRI设备己有3.0Tesla和7.0Tesla，MRI成像技术己进入称为功能性磁共振成像技木，如磁共振弥散张量成像技术（Magnetic Resonance Diffusion Tensor Imaging）、磁共振波谱成像技术(Magnetic Resonance Spectroscopic Imaging）、T1ρ值计算（T1ρ calculation）、T2弛豫时间测定（T2 relaxation time measurement）、磁共振弥散定量成像技术（diffusion quantitative imaging）和放射性核素成像技术（radio nucleotide imaging）。此种MRI成像技术是一种无创性获得活体生理及病理物质代谢的检查方法，将影像学检查深入到生物化学甚至基因水平，被称为“虚拟活检”[42,43]。这种无创性功能性磁共振成像技木对椎间盘组织生物化学测定，将明显有利于椎间盘退变造模和基因治疗体内效果的系统性观察。达到观察椎间盘由正常至不同级别退变的进程和形态以及转基因后退变级别和形态的变化。同时，为基因治疗试验应用的有效性具备影像学和细胞基质含量变化的客观评价。

5 基因治疗的安全性

在椎间盘退变基因治疗过渡到临床应用前其安全性为最重要课题。椎间盘退变基因治疗的技术基础之一，是将由病毒作为载体携带正向调控的目的基因质粒注入相对封闭无血液循环的椎间盘髓核内。但若此基因质粒注入椎间盘外进入血液循环或蛛网膜下腔将产生灾难性结果。Wallach等[44]报告Ad/TGF-β1意外地注入新西兰大白兔蛛网膜下腔内,造成瘫痪和严重的组织学改变。.若基因质粒注入新西兰大白兔硬膜外腔，其发生并发症因载体而异。应用腺病毒载体发生并发症达80%以上，应用腺相关病毒载体则无发生并发症，表明腺相关病毒安全性高[45]。为了确定基因质粒仅存在于靶椎间盘内，Sowa等[46]介绍髓核细胞用AAV-RheoSwitch GFP增大感染倍率并用Intrexon's activator标记物。，用莹光显微镜和免疫组化染色检测组织中绿色莹光蛋白（green fluorescent protein，GFP)。发现GFP仅见于病毒载体，仅有病毒和Intrexon's activator标记物，则在相邻椎间盘和组织内末见GFP。此方法可证实基因治疗限局于靶细胞中，提高其安全性。此外，在一个质粒上用有限的病毒载体量，载荷多个目的基因，增强转基因表达，减少病毒载体的用量亦为提高基因治疗安全性的方法。对于病毒类载体，尤其是谈虎色变的HIV，尽管显示其忧越性和安全性，仍需反复研究论证。

6 基因治疗应用前景

许多学者认为基因治疗是椎间盘退变生物学治疗中最具希望的工具[47]。基因治疗为致力于改变细胞基质蛋白质表达的理想方法[48]。实验研究证实BMP-7亦即骨形成蛋白-1（OP-1）和BMP-14亦即生长分化因子-5能有效地恢复退椎间盘变的结构。在此研究基础上，美国FDA已将OP-1和GDF-5作为新药临床试验[49]。

自1997年Nishida开创性地进行了退变椎间盘基因治疗的研究工作至今16年取得了一定的成果，我们仍应继续深入研究椎间盘退变的病理生理学，治疗基因的安全用量、基因表达所需持续的时间、治疗性基因对椎间盘组织结构和重建椎间盘生物力学影响等重要课题，以早日实现椎间盘退变基因治疗的临床应用。

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