李攀 顾振鹏 刘顺振＊ 刘晶晶 代培培 刘志慧

（1．滨州医学院附属医院妇科二病区，＊口腔科，山东滨州 256603；2．滨州医学院烟台附属医院妇产科，山东烟台 264100）

子宫内膜异位症（endometriosis，EMs）的发生、发展与雌激素的暴露密切相关，是雌激素依赖性疾病［1］。芳香化酶（cytochrome P450 19，CYP19）和儿茶酚氧位甲基转移酶（catechol－O－methyltransferase，COMT）是雌激素合成和代谢过程中的关键酶。因此，CYP19、COMT基因多态性可能与EMs发病有关。本研究采用高分辨率溶解曲线（high resolution melting，HRM）分析技术，佐以聚合酶链反应－限制性片段长度多态性（polymerase chain reaction－restriction fragment length polymorphism，PCR－RFLP）分析技术，研究CYP19基因240A／G、COMT基因1947G／A位点单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）与山东省滨州地区汉族妇女EMs的关系。

1 资料与方法

1．1 一般资料 2011年9月—2012年5月在滨州医学院附属医院妇产科行手术治疗并经术后病理证实的EMs患者80例（包括卵巢巧克力囊肿30例、子宫腺肌症50例）为EMs组；选择同期行妇科手术并经术后病理排除EMs的患者40例为对照组。两组患者者均为汉族，且年龄、体质量、妊娠次数比较差异均无统计学意义（P＞0．05）。患者均签署知情同意书。两组患者术后第3天取清晨空腹肘静脉血3mL，乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝，保存于－80℃冰箱。

1．2 方法

1．2．1 全血DNA的提取及检测 采用酚－氯仿提取法提取全血DNA，并用1%琼脂糖凝胶进行电泳鉴定，紫外线分光光度仪测定DNA纯度均大于1．7。

1．2．2 PCR 扩增引物的设计 参考相关文献［2－3］设计PCR引物，序列如下：（1）CYP19基因240A／G的 上 游 引 物 5＇－AGTAACACAGAACAGTTGCA－3＇，下游引物5＇－TCCAGACTCGCATGAATTCTCCGTA－3＇；（2）COMT 基因1947G／A 的上游引物5＇－T CGTGGACGCCGTGATTCAGG－3＇，下 游 引 物 5＇－AGGTCTGACAACGGGTCAGGC－3＇。以上引物均由上海生物工程有限公司合成。

1．2．3 PCR扩增条件 （1）CYP19基因240A／G位点PCR反应条件：95℃2min；95℃30s、51℃30s、72℃30s，共32个循环；最后72℃10min。（2）COMT基因1947G／A 位点PCR反应条件：95℃2min；95℃30s、59℃30s、72℃30s，共32个循环；72℃10min，4℃保存。两者PCR产物均采用2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1．2．4 采用HRM技术对基因多态性分型 （1）将9μL PCR产物与1μL LC Green于暗室中依次加入96孔PCR反应板并混匀，用1滴矿物油封液面；（2）95℃30s，25℃30s，1个循环，保存于4℃；（3）将96孔板4000r／min离心30s，放入 Lightscanner仪器中，采用软件分析溶解曲线，得出基因型，并与酶切结果相互佐证。CYP19 240A／G、COMT 1947G／A各基因型见图1～2。

1．2．5 限制性内切酶酶切 （1）CYP19 240A／G酶切反应体系：PCR产物3μL，10×T buffer 2μL，0．1%BSA 2μL，限制性核酸内切酶RsaⅠ1μL（10 U／μL），灭菌双蒸水12μL，共20μL，37℃水浴1 h；（2）COMT 1947G／A酶切反应体系：PCR产物5 μL，10×G buffer 2μL，内切酶 N1aⅢ0．5μL（5 U／μL），灭菌双蒸水12．5μL，共20μL，37℃水浴16h。以上两组酶切产物均用3%琼脂糖凝胶电泳鉴定，观察酶切条带，判断基因型。

图1 CYP19 240A／G各基因型溶解曲线

图2 COMT 1947G／AG各基因型溶解曲线

1．3 统计学处理 采用SPSS 17．0软件进行统计学分析。对两组样本的CYP19和COMT基因频率进行Hardy－Weinberg遗传平衡检验。对两组样本人群CYP19和COMT基因型及各等位基因分布频率比较采用χ2检验，计算比值比（odds ratio，OR）及95%可信区间（confidence interval，CI），以分析CYP19和COMT突变基因型及突变基因型与EMs发病风险关系。P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结 果

2．1 采用HRM分析仪得到的基因型统计 （1）CYP19 240A／G：EMs组 AA 17例，AG 41例，GG 22例；对照组 AA 22例，AG 13例，GG 5例；（2）COMT 1947G／A：EMs组GG 46例，GA 28例，AA 6例；对照组GG 24例，GA 12例，AA 4例。以上结果与酶切结果基本一致。对两基因在EMs组和对照组中的基因型频率进行Hardy－Weinberg遗传平衡检验，结果P均＞0．05，可进行χ2检验。

2．2 CYP19 240A／G各基因型及等位基因分布频率与EMs的关系 EMs组各基因型及等位基因分布频率与对照组比较，差异均有统计学意义（χ2＝14．096，P＝0．001；χ2＝12．803，P＝0．001），等位基因G突变可使EMs发病风险增加2．809倍，95%CI为1．580～4．992。EMs组携带G等位基因突变的基因型（AG＋GG）与野生型（AA）比较差异有统计学意义（χ2＝13．846，P＝0．0001），携带 AG 和GG基因型的妇女EMs发病风险增加了4．529倍，95%CI为1．992～10．300。见表1～3。

2．3 COMT 1947G／A各基因型及等位基因分布频率与EMs的关系 EMs组各基因型及等位基因分布频率与对照组比较，差异均无统计学意义（P＞0．05），表明COMT 1947G／A位点等位基因突变与EMs发病无相关性。EMs组携带A等位基因突变的基因型（GA＋AA）分别与野生型（GG）比较，差异无统计学意义（P＝0．793），这表明与野生型（GG）相比，携带A等位基因的基因型（GA＋AA）不能增加EMs的发病风险。见表1～3。

表1 EMs组及对照组CYP19、COMT各基因型分布频率比较n（%）

表2 EMs组及对照组CYP19、COMT各等位基因分布频率比较n（%）

表3 EMs组与对照组CYP19、COMT突变型和野生型比较n（%）

3 讨 论

自1980年Simpson等首次对EMs进行遗传学研究，证明该病可能有家族史后，国内外学者开始对引起EMs遗传学改变的因素进行研究。有研究［4］表明，EMs具有家族聚集性，患者一级亲属发病风险是无家族史者7倍，单卵双胎孪生姐妹发病率高达75%。近几年的研究［5］结果表明，EMs是一种由多个基因位点与环境、激素、免疫等因素相互作用所致的疾病。

HRM分析技术是近年来国际上新兴的一种检测SNP、基因突变及基因分型的工具。其原理如下：双链DNA荧光染料与PCR产物结合后，升温过程中SNP位点因不匹配会使双链DNA解开，荧光染料从局部解链的DNA分子上释放，实时监测荧光强度与时间曲线的关系就可以区分不同SNP位点和不同基因型。HRM分析技术具有操作简便、特异性高、速度快、对样品无污染等优点。

本研究应用HRM分析技术研究CYP19 240 A／G、COMT 1947G／A位点的SNP与山东省滨州地区汉族妇女EMs发病的相关性。结果显示，EMs组CYP19 240A／G位点各基因型及等位基因分布频率与对照组比较差异有统计学意义（P＜0．05），其中等位基因G突变可使EMs发病风险增加2．809倍。EMs组携带G等位基因突变的AG和GG基因型的妇女EMs发病风险增加4．529倍。EMs组COMT 1947G／A位点各基因型及等位基因分布频率与对照组比较差异无统计学意义（P＞0．05），说明COMT 1947G／A位点多态性与EMs发病无相关性。携带A等位基因突变的基因型（GA＋AA）并不增加EMs的发病风险。

采用HRM分析SNP是近年来新兴的检测手段，其特异性高、耗时短，适用于大样本统计研究。本实验所研究的基因种类局限，且样本量较少，在统计中难免出现偏差，仅代表部分滨州汉族妇女的情况。在今后的研究中，应采取多地区、多种族、大样本、多基因联合的研究，以更好的研究EMs的发病机制。

［1］ Kitawaki J，Kado N，Ishihara H，et al．Endometriosis：the pathophysiology as an estrogen－dependent disease［J］．J Steroid Biochem Mol Biol，2002，83（1－5）：149－155．

［2］ Miyoshi Y，Iwao K，Ikeda N，et al．Breast cancer risk associated with polymorphism in CYPl9Japanese women［J］．Int J Cancer，2000，89（4）：325－328．

［3］ Kunuqi H，Nanko S，Ueki A，et al．High and low activity alleles of Catechol－O－methyltransferase gene：ethnic difference and possible association with Parkinson’s disease［J］．Neurosci Lett，1997，221（2－3）：202－204．

［4］ 乐杰．妇产科学［M］．第7版．北京：人民卫生出版社，2008：326－327．

［5］ Bischoff F，Simpson JL．Genetic basis of endometriosis［J］．Ann NY Acad Sci，2004，1034：284－299．