吕国伟 朱继 籍新潮 万伟峰 徐睿

（重庆医科大学附属第一医院神经外科，重庆 400016）

目前，越来越多的研究［1］表明，蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）对早期脑损伤（early brain injury，EBI）的发展起重要作用，尤其是SAH后急性脑血管痉挛（cerebral vasospasm，CVS）的发生及痉挛程度与患者病情进展的严重程度及其预后密切相关。引起早期急性CVS的病理因素有很多，如红细胞破坏后释放血红蛋白、内皮细胞受损后一氧化氮释放减少、血管壁炎性反应、血管平滑肌细胞内皮素受体激活、血管平滑肌细胞及内皮细胞凋亡等，但其具体机制仍不明确［2－6］。含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶（a disintegrin－like and metalloproteinase with thrombospondin type 1motifs，ADMTS－1）是一种新近发现的基质金属蛋白酶。研究［7］发现，ADAMTS－1与神经系统多种疾病的发生、发展密切相关，有望成为多种神经损伤的标志蛋白及药物治疗靶点。本课题通过研究大鼠SAH后早期基底动脉中ADAMTS－1的表达及其与CVS的关系，探讨ADAMTS－1在SAH后EBI中的作用。

1 资料与方法

1．1 实验动物与主要试剂 健康成年雄性SD大鼠108只，体质量250～300g，随机分为假手术组（sham组，n＝18）和SAH 组（n＝90）。SAH 组随机分为SAH 6h、12h、24h、48h、72h5个亚组，每个亚组各18只。sham组及SAH组各亚组中的6只SD大鼠用来检测基底动脉 ADAMTS－1的mMRA表达，6只用来检测ADAMTS－1蛋白表达，6只用来测量基底动脉管径及管壁厚度。ADAMTS－1抗体购自美国Santa Cruz公司；Trizol试剂盒、实时荧光定量逆转录－聚合酶链反应（RTPCR）检测试剂盒购自日本Takara公司。

1．2 建立SAH模型 根据文献［8］报道，采用改良的视交叉池注血法建立大鼠SAH模型。用3．5%水合氯醛（10mL／kg）将大鼠麻醉后，将其固定于脑立体定向仪，局部剪毛消毒后沿颅顶正中矢状线切开皮肤，钝性分离肌肉及骨膜后在冠状缝前5．0cm、中线旁开3．0cm处，用牙科钻钻孔。显露额极，以4号针头挑破硬脑膜，见清亮脑脊液流出时，将PE10导管尖端从额极紧贴前颅窝底蛛网膜下腔向双耳连线中点送入约10mm。经大鼠股动脉抽取自体动脉血300 μL，经PE10导管15s内缓慢注入，拔出导管，以骨蜡封闭骨孔，缝合头皮并消毒后维持头低位30min。sham组大鼠按以上方法操作，但在视交叉池内注入等量0．9%氯化钠液。

1．3 检测大鼠基底动脉 ADAMTS－1mRNA 按Trizol试剂盒说明书提取基底动脉总RNA。采用两步法RT－PCR试剂盒配置反应体系。ADAMTS－1及3－磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）引物均由日本Takara公司设计并合成。ADAMTS－1上游引物为gataagtgtggcgtttgtggag，下 游 引 物 为 gatggtcaggggttctttgagt，扩增片段长度为336bp。内参照GAPDH上游引物为gtgctgagtatgtcgtggagtct，下游引物为gtggaagaatgggagttgctgt，扩增片段长度为610bp。将RT－PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下摄照，比较电泳条带相对光密度值。

1．4 提取基底动脉蛋白 SAH各亚组大鼠于相应时间点、sham组大鼠于72h迅速断头取脑，分离基底动脉并置于液氮保存。之后，取出基底动脉，将其置于1．5mL EP管中，加入全细胞蛋白裂解液后用电动匀浆器吹打5s，然后于4℃以12 000r／min离心5min，收集上清液，保存于－80℃冰箱中备用。

1．5 蛋白质印迹（Western－blot）法及 RT－PCR法检测基底动脉ADAMTS－1蛋白及mRNA的表达 按常规方法进行

1．6 基底动脉组织形态学观察 分别在基底动脉大脑后动脉处、基底动脉中段、椎动脉汇合处取材，制成5μm厚度切片，进行HE染色。观察基底动脉形态变化，参考文献［9］中的方法分别计算3个层面的管腔直径，取其平均值；在高倍镜（10×40）下测量基底动脉管壁厚度，取3个层面的平均值。

1．7 统计学处理 采用SPSS 13．0统计软件分析，数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用最小显著差数法检验（least significant difference，LSD）。变量之间采用Pearson相关分析检验。检验水准ɑ＝0．05。以P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结 果

2．1 大鼠基底动脉ADAMTS－1mRNA表达 与sham组相比较，SAH 6h亚组大鼠基底动脉ADAMTS－1的mRNA表达的差异无统计学意义（P＝0．24）；SAH 12h亚组大鼠基底动脉 ADAMTS－1mRNA表达增高（P＝0．008）；SAH 24h亚组基底动脉 ADAMTS－1mRNA 表 达 达到高峰 （P＝0．003）；SAH 48h 亚组基底 动脉 ADAMTS－1的mRNA表达较SAH 24h亚组开始下降（P＝0．005）；72h亚组基底动脉 ADAMTS－1mRNA 表达降至最低（P＝0．007），见图1。

图1 sham组及SAH各亚组大鼠基底动脉ADAMTS－1mRNA表达水平比较

2．2 大鼠基底动脉 ADAMTS－1蛋白表达 与sham组相比较，SAH 6h亚组大鼠基底动脉ADAMTS－1蛋白表达差异无统计学意义（P＝0．266）；SAH 12h亚组大鼠ADAMTS－1蛋白表达开始升高（P＝0．007），24h亚组达到高峰（P＝0．003），在48h亚组开始下降（P＝0．005），72h亚组仍维持在较高水平（P＝0．008），见图2～3。

2．3 大鼠基底动脉光镜下的形态学观察sham组大鼠基底动脉内膜光滑完整，无褶皱。与sham组大鼠相比较，SAH 6h亚组大鼠基底动脉管壁厚度和管腔直径的差异无统计学意义（管壁厚度P＝0．302；管腔直径P＝0．233）；SAH 12h亚组大鼠基底动脉内膜开始出现褶皱，管壁增厚（P＝0．006），管腔缩小（P＝0．004）；24h亚组大鼠基底动脉痉挛最明显，内膜明显皱缩，管壁显著增厚（P＝0．002），管腔显著变小（P＝0．001）；48h亚组大鼠基底动脉内膜皱缩减轻，管腔较24h亚组增大（P＝0．007），管壁较24h亚组变薄（P＝0．006）；72h亚组大鼠基底动脉内膜未见明显褶皱，管壁进一步变薄（P＝0．009），管腔显著增大（P＝0．007），见图4～6。

图2 Western－blot显示大鼠基底动脉ADAMTS－1蛋白表达水平

图3 sham组及SAH各亚组大鼠基底动脉ADAMTS－1蛋白表达比较

图4 sham组及SAH组各亚组大鼠基底动脉形态学比较

图5 sham组及SAH各亚组大鼠基底动脉校正管腔直径（μm）比较

图6 sham组及SAH各亚组大鼠基底动脉校正管壁厚度（μm）比较

2．4 SAH后早期基底动脉ADAMTS－1蛋白表达与急性CVS的关系 统计学分析显示，大鼠SAH后早期基底动脉ADAMTS－1蛋白表达与急性CVS呈正相关（r＝0．916，P＝0．003）。

3 讨 论

自发性SAH是发病率及死亡率均较高的急性出血性脑血管综合征，50%以上是由颅内动脉瘤破裂引起，又称动脉瘤性蛛网膜下腔出血。再出血及SAH后迟发性脑血管痉挛（delayed cerebral vasospasm，dCVS）而导致的迟发性缺血性神经功能障碍（delayed ischemic neurological deficits，DIND）是导致患者死亡或残疾的最主要原因。尼莫同等钙离子拮抗剂及内皮素受体抑制剂的应用虽能明显缓解CVS，但不能降低aSAH患者的死亡率。Cahill等［10］汇总大量的研究结果发现，SAH后EBI的发生及严重程度在很大程度上影响SAH患者的预后。SAH后急性CVS可导致脑血流量（cerebral blood flow，CBF）急剧下降，脑灌注压也随之降低，大脑发生局部或弥漫性的缺血、缺氧性改变，这在EBI的病理过程中起着重要的作用。ADAMTS－1与ADAMTS家族其他成员一样，具有血小板反应素基序（thrombospondin，TSP），属于分泌型蛋白，其被分泌后可通过C末端3个TSP重复序列和间隔区锚定在细胞外基质中，并通过降解细胞外基质蛋白参与多种病理生理过程。研究［11］发现，ADAMTS－1能够酶解血管基质蛋白，促进血管平滑肌的增殖和移位，从而参与动脉血管壁的损伤；另外，ADAMTS－1还可通过其C－末端与血管内皮细胞生长 因 子 （vascular endothelial growth factor，VEGF）的肝素区结合，进而抑制内皮细胞增殖，影响血管收缩与舒张功能的调节。目前，国内外关于ADAMTS－1与脑血管疾病的研究尚不多。Crossa等［12］研究发现，大鼠大脑中动脉短暂闭塞后，星形胶质细胞中ADAMTS－1mRNA表达升高；而且肿瘤坏死 因子－α（tumor necrosis factor－alpha ，TNF－α）等炎性反应介质可上调ADAMTS－1在星形胶质细胞中的表达，加速细胞外基质的降解，促使神经细胞从基膜脱落、凋亡。

本研究发现，与sham组相比，SAH后6h大鼠基底动脉 ADAMTS－1mRNA含量及 ADAMTS－1蛋白表达无显著差异；SAH后12h基底动脉ADAMTS－1mRNA含量及ADAMTS－1蛋白表达显著升高，于24h达到高峰，48h开始下降，72h仍高于sham组水平。同时，与sham组比较，SAH后6h大鼠基底动脉形态无显著变化；SAH后12h大鼠基底动脉管径变小，管壁增厚，内膜呈波浪状改变；24h大鼠基底动脉痉挛最明显，内皮细胞部分脱落，内膜明显皱缩；48h大鼠基底动脉管腔较24h增大，管壁变薄，内膜皱缩减轻；72h大鼠基底动脉管径显著增大，管壁进一步变薄，内膜皱缩明显减轻。SAH后早期大鼠基底动脉中ADAMTS－1的表达与急性CVS呈正相关，提示SAH后ADAMTS－1参与大鼠基底动脉早期急性CVS的发生，但其具体病理机制尚待进一步研究。

［1］ Baldwin ME，Macdonald R，Huo D，et al．Early vasospasm on admission angiography in patients with aneurismal subarachnoid hemorrhage is a predictor for in－hospital complications and poor outcome ［J］．Stroke，2004，35（11）：2506－2511．

［2］ Luo C，Yi B，Chen Z，et al．PKGIαinhibits the proliferation of cerebral arterial smooth muscle cell induced by oxyhemoglobin after subarachnoid hemorrhage［J］．Acta Neurochir Suppl，2011，110（Pt1）：167－171．

［3］ Vatter H，Weidauer S，Dias S，et al．Persistence of the nitric oxide－dependent vasodilator pathway of cerebral vessels after experimental subarachnoid hemorrhage［J］．Neurosurgery，2007，60（1）：179－187；discussion187－188．

［4］ Muroi C，Mink S，Seule M，et al．Monitoring of the inflammatory response after aneurysmal subarachnoid haemorrhage in the clinical setting：review of literature and report of preliminary clinical experience［J］．Acta Neurochir Suppl，2011，110（Pt1）：191－196．

［5］ 陈开来，鲁晓杰，张晓彪，等．颅内动脉瘤出血患者脑脊液NO、NOS和ET含量的变化［J］．中国临床医学，2007，13（4）：561－563．

［6］ Cheng G，Wei L，Zhi－Dan S，et al．Atorvastatin ameliorates cerebral vasospasm and early brain injury after subarachnoid hemorrhage and inhibits caspase－dependent apoptosis pathway［J］．BMC Neurosci，2009，10（7）：1186－1197．

［7］ Haddock G，Cross AK，Plumb J，et al．Expression of ADAMTS－1，－4，－5and TIMP－3in normal and multiple sclerosis CNS white matter［J］．Mult Scler，2006，12（4）：386－396．

［8］ Ansar S，Svendgaard NA，Edvinsson L，et al．Neurokinin－1 receptor antagonism in a rat model of subarachnoid hemorrhage：prevention of upregulation of contractile ETB and 5－HT1Breceptors and cerebral blood flow reduction［J］．J Neurosurg，2007，106（5）：881－886．

［9］ Burgos－Ramos E，Puebla－Jiménez L，Arilla－Ferreiro E，et al．Minocycline provides protection against beta－amyloid（25－35）－induced alterations of the somatostatin signaling pathway in the rat temporal cortex［J］．Neuroscience，2008，154（4）：1458－1466．

［10］ Cahill WJ，Calvert JW，Zhang JH，et al．Mechanisms of early brain injury after subarachnoid hemorrhage［J］．J Cereb Blood Flow Metab，2006，26（11）：1341－1353．

［11］ Jönsson－Rylander AC，Nilsson T，Fritsche－Danielson R，et al．Role of ADAMTS－1in athemsclemsis：remodeling of carotidartery，immunohistochemistry，and proteolysis of versican［J］．Arterioscler Thromb Vasc Biol，2005，259（1）：180－185．

［12］ Crossa AK，Haddocka G，Stockc CJ，et al．ADAMTS－1and－4are up－regulated following transient middle cerebral artery occlusion in the rat and their expression is modulated by TNF in cultured astrocytes［J］．Brain Res，2006，1088（1）：19－30．