董盛宇，刘付梅，李祥勇

1.吴川市人民医院五官科(广东 吴川524500)

2.广东医学院生物化学与分子生物学研究所(广东湛江524023)

鼻咽癌是发生于鼻咽粘膜的恶性肿瘤，具有较高的致死率，中晚期患者放化疗后的5年生存率往往低于60%。目前鼻咽癌患者的治疗主要采用放射治疗，结合化学治疗和手术治疗，但由于放疗容易产生局部复发和远处转移，以及肿瘤细胞对化学药物容易产生耐受和化学药物的严重毒副作用，限制了其患者生存率和生存质量的提高。近年来，传统中药的多靶点作用机制、较少不良反应等优点表现出诱人的应用前景，筛选出高效低毒的抗肿瘤中药是研究热点之一。藏红花素是鸢尾科番红花属球根类草本植物藏红花的提取产物［1］，自古便是活血化瘀的良药，素有“植物黄金”之称。近年来的研究发现藏红花的主要提取产物——藏红花素(crocin，分子式C44H64O24，分子量为977，水溶性，红色或橙黄色粉末)具有广谱抗癌活性，对肝癌［2］、结肠癌［3］、胃腺癌［4］和舌鳞状细胞癌［5］都具有较强的抑制作用。本课题研究了crocin对人鼻咽癌细胞株CNE2的影响，通过测定不同浓度的crocin对细胞增殖和迁移能力的抑制作用，初步探讨该过程中可能存在的作用机制以及藏红花素作用于鼻咽癌细胞株的有效作用浓度，从而为进一步鼻咽癌临床治疗方案的优化以及中药治疗药物的开发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 Crocin购自四川成都曼思特生物科技有限公司;CNE2细胞株为本科室保存;RPMI MEDIUM 1640培养基购自美国Gibco公司;胎牛血清购自四季青公司;TRIzol试剂购自Invitrogen公司;RT－PCR试剂盒购自大连宝生物;PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成;CCK－8试剂盒和结晶紫染色液购自碧云天生物技术研究所;Transwell小室购自美国Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 crocin溶液的配制 无菌条件下将 20 mg crocin溶于4 ml高压灭菌过的PBS溶液(0.01 mol/L、pH=7.4)中，并加入 12.5mg EDTA(crocin 的稳定剂)配成5mmol/L的储存液，4℃贮存。临用时根据实验需要稀释为适当浓度。

1.2.2 高倍显微镜观察 在CNE2细胞中加入不同浓度的crocin并作用24 h后，使用高倍显微镜观察CNE2细胞形态的变化。

1.2.3 CCK－8实验 取对数生长期的CNE2细胞，进行细胞计数，用完全培养基调整细胞密度并接种到96孔平板，每孔细胞数为1×104个，将平板置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。细胞贴壁后，吸出上清，加入含藏红花素的培养基100 μl，使CNE2 细胞藏红花素的浓度为 0、0.2、0.4、0.6、0.8 和1.0mmol/L，继续培养24 h。每个实验组设6个复孔。在实验终止前1h加入CCK－8试剂，37℃恒温箱中孵育1h，使用酶标仪按照双波长方式测定每孔吸光度(OD值)，测定波长为450 nm，参比波长为655nm。按以下公式计算细胞存活率和药物抑制率:

1.2.4 Transwell小室迁移实验 各组细胞加药培养24h后，予PBS清洗2次，胰酶消化收集细胞，用无血清培养基重悬细胞(实验前12 h去血清培养);取出Transwell小室，置于与之配套的24孔板上;在Transwell小室上室中加入用无血清培养基重悬的细胞1×105个，下室加500 μl含 20%FBS的培养基培养;24h后结晶紫染色观察，在高倍视野下观察穿过膜的细胞数。

1.2.5 RT－PCR 实验 分别用浓度为 0、0.2、0.4、0.6mmol/L的crocin作用于CNE2细胞24 h，使用TRIzol法提取细胞总RNA。使用RT－PCR试剂盒按照一步法进行实时定量PCR扩增:目的基因为bi－1，上游引物 5’－CCTCTTCTGGTGGATGCTTTG－3’，下游引物 5’－GCCTCGCTCTGTTGATGTGA－3’;内参为 ACTB，上游引物 5’－TGGCACCCAGCACAATGAA－3’，下游引物 5’－CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA－3’。反应条件为:95℃ 5 min;95℃ 15s，60℃ 15 s，72℃ 31 s;40 个循环(ABI 7300 Real－Time system)。反应结束后，实验数据用系统自带软件进行分析。相对定量实验使用的分析方法为比较Ct值法。Ct值表示阈值循环，是荧光信号强度超过设置的阈值强度时所经历的循环数。因为Ct值与反应管中模板起始拷贝数的对数存在线性对应关系，根据公式:

计算CNE2加药组细胞相对于空白对照组细胞bi－1 的表达量 2－△△Ct。

2 结果

2.1 形态学观察 CNE2细胞加药培养24 h后，在高倍显微镜下(目镜10×，物镜20×)观察细胞形态。空白对照组鼻咽癌细胞排列紧密而规则，细胞核大，细胞边界清晰，细胞膜完整(图1－A);crocin浓度较低组(0.2～0.6 mmol/L)细胞形态变化并不明显(图1－B、C、D);crocin 浓度较高组(0.8～1.0 mmol/L)细胞形态发生明显变化，细胞死亡增加，细胞核固缩、细胞大小不一、形状不规则，细胞排列紊乱，且浓度越大，细胞死亡越多(图 1－E、F)。

图1 不同浓度crocin药物培养后CNE2细胞形态(200×)

2.2 crocin对CNE2细胞的增殖抑制作用 从加入的crocin浓度为0.2mmol/L开始至浓度依次增大到1.0mmol/L，细胞存活率依次下降(P＜0.05)，且具有明显的浓度依赖性(图2);各组CNE2细胞生存率间差异具有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1 crocin对CNE2细胞增殖的影响

图2 crocin对CNE2细胞增殖的影响

2.3 Transwell小室迁移实验 Transwell小室实验结束后，高倍显微镜观察CNE2细胞穿过膜的细胞数。结果显示，加药24h后，随着crocin加入浓度的增加，穿过小室的细胞数目逐渐减少(图3)。说明在浓度 0.2～1.0 mmol/L范围内，crocin可抑制CNE2细胞的迁移能力，并具有浓度依赖性。

2.4 RT－PCR实验 因当 crocin浓度高于 0.8 mmol/L时，细胞凋亡严重，故选取crocin浓度为0.2～0.6mmol/L进行 RT－PCR 实验，测定细胞中抗凋亡基因bi－1的表达含量的变化。RT－PCR结束后，使用ABI 7300 system系统自带软件进行分析，当加入的 crocin 浓度为 0.2、0.4、0.6mmol/L 时，细胞中 bi－1基因的表达含量分别降低了5.45%、29.96%和33.57%(图 4)。

3 讨论

中药藏红花又名西红花、番红花，是一种名贵的传统中药材，近年来被列为国家重点发展的39种中药之一［6］。随着现代药物提取技术、生化分析技术和分子生物学技术的发展，人们对于藏红花的药物作用机理逐步有了较为深入的研究。藏红花素是藏红花最主要的一种色素，由藏红花酸(crocetin)糖基化形成，是极其少见的水溶性类胡萝卜素［7］。近年来的研究发现，藏红花素对心血管系统［8］、肝脏［9］、肾、脑［10］等都有一定的保护作用，临床上常用于肝脏疾病、冠心病、心绞痛以及重型颅脑损伤后合并褥疮［7］等疾病的治疗。在肿瘤领域，近年来国内外的流行病学调查和实验研究均表明，藏红花素对多种肿瘤均有明显的防治作用，而在其抗肿瘤作用机制方面，文献报道多集中于藏红花素诱导凋亡及影响细胞周期等机制的研究，但结论不甚详尽完善，因而藏红花素抗肿瘤作用机制仍未完全明确。

图3 Transwell小室迁移实验(200×)

图4 RT－PCR测定crocin对CNE2细胞中bi－1基因表达的影响

本研究选取鼻咽癌细胞株CNE2为靶细胞进行藏红花素的抗肿瘤效应研究，观察了不同浓度藏红花素对CNE2细胞增殖和迁移能力的影响。结果发现浓度为0.2～1.0 mmol/L的藏红花素均可明显抑制CNE2细胞的增殖活力和迁移能力，表明藏红花素对鼻咽癌细胞具有明显的抑制作用。为进一步探讨其可能的作用机理，选取抗凋亡基因bi－1为指标，进一步使用RT－PCR方法测定了不同实验组CNE2细胞中bi－1表达含量的变化。结果显示在0～0.6 mmol/L范围内，随着藏红花素浓度的提高，CNE2细胞中bi－1表达量逐渐降低;而当藏红花素浓度超过0.8 mmol/L时，细胞凋亡加剧。这说明在低浓度下，藏红花素很有可能是通过调控凋亡抑制基因bi－1的表达降低了细胞的增殖和迁移能力;而在较高浓度下，我们的实验结果显示藏红花素可强烈抑制鼻咽癌细胞CNE2的生长，当藏红花素浓度为1.0mmol/L时，细胞死亡率甚至高达99%以上，推测高浓度的藏红花素也很有可能会杀死正常细胞，不建议临床应用。这些实验结果也同时为我们中药抗肿瘤试剂的开发以及临床用药浓度的确定奠定了一定的基础。

综上所述，藏红花素对CNE2细胞具有明显的增殖和迁移抑制作用，其作用机制可能是通过降低CNE2细胞中凋亡抑制基因bi－1的表达增加细胞凋亡来实现的。

［1］郝坡，孟凡萍，刘北忠.藏红花素对K562细胞株及裸鼠移植瘤的抑制作用的研究［J］.中国预防医学杂志，2011，12(10):822－825.

［2］Noureini SK，Wink M.Antiproliferative effects of crocin in HepG2 cells by telomerase inhibition and hTERT downregulation［J］.Asian Pac J Cancer Prev，2012，13(5):2305－2309.

［3］Kawabata K，Tung NH，Shoyama Y，et al.Dietary Crocin Inhibits Colitis and Colitis－Associated Colorectal Carcinogenesis in Male ICR Mice［J］.Evid Based Complement Alternat Med，2012，doi:10.1155/2012/820415.

［4］Hoshyar R，Bathaie SZ，Sadeghizadeh M.Crocin Triggers the Apoptosis Through Increasing the Bax/Bcl－2 Ratio and Caspase Activation in Human Gastric Adenocarcinoma，AGS，Cells［J］.DNA Cell Biol，2013，32(2):50－57.

［5］Sun J，Xu XM，Ni CZ，et al.Crocin inhibits proliferation and nucleic acid synthesis and induces apoptosis in the human tongue squamous cell carcinoma cell line Tca8113［J］.Asian Pac J Cancer Prev，2011，12(10):2679－2683.

［6］季文军，代文婷.中药藏红花的研究概况［J］.中药与天然药物，2011，23(10):79－81.

［7］Abdullaev F I，Espinosa－Aguirre J J.Biomedical properties of saffron and its potential use in cancer therapy and chemoprevention trials［J］.Cancer Detect Prev，2004，28(6):426－432.

［8］吴扬，潘瑞蓉，耿鹏.藏红花素抗心肌细胞低氧损伤作用及其机制研究［J］.中国应用生理学杂志，2010，26(4):453－457.

［9］Shati AA，Alamri SA·Role of saffron(Crocus sativus L·)and honey syrup on aluminum－induced hepatotoxicity［J］.Saudi Med J，2010，31(10):1106－1113.

［10］Vakili A，Einali MR，Bandegi AR.Protective Effect of Crocin against Cerebral Ischemia in a Dose－Dependent Manner in a Rat Model of Ischemic Stroke.J Stroke Cerebrovasc Dis［J］.2012 Nov 19.pii:S1052－3057(12)00345－X.doi:10.1016.