武彩霞，高学军，李庆章，骆超超，毕微微，史琳琳，张 莉

（1.河北北方学院生命科学研究中心，河北 张家口 075000；2.东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨 150030）

益生菌发酵饲料集益生菌功效与优质饲料优点，在畜禽生产中具有广阔应用前景[1]。枯草芽孢杆菌作为发酵饲料益生菌之一，已广泛用于生产，具有增进畜禽生长性能和较强抗性等优点，在饲料制粒、储存及在胃肠道中作用稳定并保持较高活性[2]。赖氨酸是人类和动物营养所必需限制性氨基酸，在动物体内会影响其他氨基酸利用率。利用基因工程方法已经成功地将富含赖氨酸基因[3]和富含蛋氨酸基因[4]分别单独转入枯草芽孢杆菌中，并通过发酵枯草芽孢杆菌提高发酵饲料中赖氨酸和蛋氨酸含量，本文旨在研究将另外一种高赖氨酸基因（cflr）转入枯草芽孢杆菌中，以提高枯草芽孢杆菌中赖氨酸含量，并提高发酵饲料中赖氨酸含量。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料

辣椒花药（采自东北农业大学香坊实验实习基地）；野生型枯草芽孢杆菌168（B.subtilis168）（ATCC27370）为本实验室保存；E.coliTOP10和pMD18-T载体，购自大连宝生物科技有限公司；枯草芽胞杆菌表达载体pHT43购自Axygen公司。

1.1.2 药品

Trizol试剂购自Invitrogen公司；PrimeScript RT-PCR Kit、SYBR®Premix Ex Taq™ Ⅱ（Perfect Real Time)、ExTaq酶、T4DNA连接酶、DNA Marker、限制性内切酶以及蛋白Marker，购自大连宝生物科技有限公司；氨苄青霉素、氯霉素、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）购自上海生工生物工程公司；L-赖氨酸标准品和1-氯-2,4-二硝基苯（CDNB）购自SIGMA公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自Axygen公司；EA⁃SYspin细菌RNA快速提取试剂盒购自北京艾德莱生物科技公司；……