林裕胜 王隆柏 吴学敏 周伦江* 邵良平

（1.福建农林大学动物科学学院 福州 350002；2.福建省农业科学院畜牧兽医研究所 福州 350013）

猪流行性腹泻（Porcine Epidemic Diarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV）引起的猪的一种急性、高度接触性肠道传染病，发生于各种年龄猪，其中对哺乳仔猪的危害最为严重，以腹泻、呕吐和脱水为临床特征。1978年英国首次报道PED，并确定为一种冠状病毒引起的疾病［1］。在之后2年，Debouck P等在许多国家和地区对该病进行了血清学调查，结果都检测到PEDV 特异性抗体的存在［2］。我国于1980年首次分离到PEDV，以后许多地区均有PED 发生的报道，且流行范围逐渐扩大。崔现兰等对26个省、市、自治区的调查表明，因PED 导致的猪死亡率占36 种猪病总死亡率的1.74%，同时PED 与TGE的混感率近年已上升至30.77%［3］。2011年甘海霞等应用RT-PCR 对来自广东省34个县144个不同规模猪场的216 份临床猪粪样的检测结果表明，很多猪场普遍存在TGEV和PEDV，尤其以PEDV 感染更为严重，阳性率达27.8%［4］。为了进一步弄清福建省PEDV的分布和感染情况，2012-2013年上半年笔者对采自福建省62个规模猪场128 份发生腹泻的病料进行了PEDV 病原学检测，研究分析PEDV在猪群中的感染及流行规律，为猪流行性腹泻的防治提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 组织样品 2012-2013年上半年采集福建省9个地级市62个规模猪场的腹泻样品128 份，样品组织经剪碎、研磨，按1︰10 比例加TE 液稀释，-70 ℃保存备用。

1.1.2 主要试剂 病毒RNA 提取试剂盒购置OMEGA 公司，病毒DNA 提取试剂盒购自ROCHE公司，PCR 扩增试剂盒购置北京全式金生物科技有限公司，AMV 酶、dNTP和DNA Marker-2000 购自TaKaRa 公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 参照GenBank 中已发表的PEDV、TGEV、PROV的基因序列，设计合成检测引物。PEDV的检测引物，Up-5’-ATGTCTAACGGTTCTATTCCCGTTG-3’，Down-5’-TTAGACTAAA TGAAGCACTTTCTCA-3’，预期片段为563 bp；TGE V 检测引物，UP-5’-CTTCTAAATGGCCAACCAGGG AC-3’，Down-5’-CGAGCATCTCGTTTAGTTCGTT-3’，预期片段为1 168 bp；PROV 检测引物，Up-5’-GTATGGTATTGAATATACCAC-3′，Down-5’-GATC CTGTTGGCCATCC -3’，预期片段为342 bp；其他病毒引物参考文献［5］进行设计合成。引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。

1.2.2 核酸提取 采用病毒RNA/DNA 提取试剂盒，参照操作说明，分别提取组织样品的总RNA/D NA，-70 ℃保存备用。

1.3 RT-PCR 或PCR 病原检测 采用北京全式金生物科技有限公司RT-PCR 扩增试剂盒，按照试剂盒提供的操作手册配制反应体系，RT-PCR 反应体系：Total RNA 4μL、5×TransScriptTM All-in-One SuperMix for PCR 4μL、Rnase-free Water 12μL，反应条件：25 ℃10 min，42 ℃30 min，85 ℃5 min。

PCR 反 应 体 系：2×GoTaq Master Green Mix 12.5μL，上下游引物各0.5μL，cDNA 或DNA 模版3μL，无菌去离子水8.5μL，混匀后进行扩增，条件为：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，53～61℃复性30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃终延伸5 min。取7μL 进行1%琼脂糖凝胶电泳，观察结果。

1.4 PEDVORF3和M 基因遗传进化分析 选取3个猪群发病严重的规模猪场采集的阳性PEDV 病料，扩增其ORF3和M 基因，将目的片段送生工生物工程（上海）有限公司进行测序，采用DNAstar 软件进行遗传进化分析。

2 结果与分析

2.1 PEDV 检测结果 对2012年至2013年上半年福建省各县市采集的128 份腹泻病料进行PEDV、TGEV、PROV、CSFV、PRRSV和PRV 检测。结果显示：PEDV的阳性率为67.97%（87/128），其中PEDV和TGEV 混合感染为19.53%（25/128），PEDV和PROV 混合感染为3.91%（5/128），PEDV和PRV 混合感染为14.84%（19/128），PEDV 与PRRSV 混合感染为6.25%（8/128）。见表1，部分电泳图见图1。

表1 PEDV 检测情况表

图1 PEDV 检测电泳图

2.2 PEDV ORF3和M 基因遗传进化分析 分别对发病严重的猪场采集的阳性病料进行了PEDV ORF3和M 基因扩增，均能扩增出目的片段。将阳性产物进行序列测序，获得了3 株PEDV，命名为FJFZ、FJPT和FJ YX 毒株。通过软件分析表明：3 株PEDV 在ORF3 基因划分成2个主分支，其中FJFZ毒株与韩国毒株、中国大陆毒株处于一大分支，FJPT 毒株单独于另一分支，FJ YX 单独处于一大分支，与attenuate DR13 弱毒株和致弱的CV777truncated 毒株的亲缘关系较远（见图2）。3 株M 基因中以FJFZ 毒株和FJPT 毒株与CV777 标准毒株处于同于小分支，亲缘关系较近，而FJYX 毒株单独处于一大分支（见图3）。

图2 4 株PEDVORF3 基因核苷酸遗传进化树

图3 4 株PEDV M 基因核苷酸遗传进化树

3 讨论

1）2010年下半年以来，猪流行性腹泻病毒造成了我国大量的小猪死亡，特别是对于饲养管理等条件不良的猪场，往往造成哺乳仔猪大量脱水、死亡。因此，该病成为严重影响我国养猪业健康的重要疫病之一。本次调查采集仔猪腹泻病料的样品，PEDV检出阳性率高达60.8%，而且存在PEDV 与TGEV、PEDV 与PROV、PEDV 与PRV、PEDV 与PRRSV 混合感染，与临近省市相比，福建省的PEDV 疫情相对严重，应该引起养殖场的重视。

2）鉴于近年来PED 发病严重，能导致90%以上的发病哺乳仔猪死亡，而且具有防控难的特点，多数从业人员怀疑流行毒株是否发生了遗传变异。因此，笔者分别从3个发生严重腹泻的猪场采集了3 份病料进行ORF3和M 基因序列测定，核苷酸遗传进化树分析表明，3 株PEDV 毒株的ORF3 基因和M 基因均存在基因突变，其中FJ YX 毒株与CV777 亲缘关系较远，M 基因片段与CV777和泰国流行毒株的亲缘关系较远。

［1］Pensaert M B，Debouck P.A New Coronavirus-like Particle Associated with Diarrhea in Swine［J］.Arch.Virol，1978，58：237-243.

［2］Debouck P，Pensaert M.Experimental Infection of Pigs with a New Porcine Enteric Coronavirus，CV 777［J］.Am J Vet Res，1980，41（2）：219-223.

［3］崔现兰，马思奇，王明，等.应用免疫荧光法诊断猪流行性腹泻的研究［J］.中国畜禽传染病，1990（5）：20-24.

［4］甘海霞，梁晟，韦显凯，等.2011年广西猪群猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎调查［J］.动物医学进展，2012，33（10）：125-127.

［5］王隆柏，庄向生，周伦江，等.福建省规模猪场伪狂犬病流行病学调查与分析［J］.中国畜牧兽医，2008，35（11）：119-121.