刘琼，何颖，沈先荣，莫琳芳，王庆蓉，陈伟，蒋定文，侯登勇，何晓义，钱甜甜，刘玉明，李珂娴

应用基因芯片技术筛选与电离辐射剂量相关的血清细胞因子

刘琼，何颖，沈先荣，莫琳芳，王庆蓉，陈伟，蒋定文，侯登勇，何晓义，钱甜甜，刘玉明，李珂娴

目的利用基因芯片技术初步筛选对电离辐射剂量敏感的血清细胞因子并分析其变化规律。方法健康雄性C57BL/6小鼠80只，随机分为对照组(n=20)和辐射组(n=60)。辐射组大鼠分别接受剂量为3、5、10Gy的60Co一次性照射，每个剂量组20只。照射后6h经眼球取血，留存血清。采用基因芯片技术检测血清细胞因子基因的表达水平，筛选出有变化的细胞因子，分析其变化规律。结果共筛选96种细胞因子。当辐射剂量为3Gy时，有44种细胞因子表达发生变化，当辐射剂量为5Gy和10Gy时，分别有47种和66种细胞因子表达发生变化。进一步分析发现，有14种因子表达呈剂量-效应依赖，其中7种随剂量上升表达增加，7种随剂量上升表达下调。结论通过基因芯片技术筛选的辐射敏感的细胞因子，其随辐射剂量的变化存在一定规律，这种规律对估算电离辐射剂量有一定意义。

辐射，电离；细胞因子类；辐射剂量

电离辐射能诱导机体产生一系列生物反应[1-2]，炎症因子在这一复杂的反应网络中起着重要作用。目前已知的在电离辐射之后发生变化的细胞因子数量有限，而基因芯片是同时检测大量标本的有利工具。本研究利用基因芯片技术，初步筛选对电离辐射剂量敏感的血清细胞因子，为进一步筛选可用于电离辐射剂量估算的细胞因子指标奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 雄性C57BL/6纯系小鼠，7周龄，体重20±1g，购于苏州工业园区爱尔麦科技有限公司(动物质量合格证号2013897)，饲养于SPF级动物房[动物饲养许可证号SCXK(苏2009-000)]。80只小鼠随机分为对照组(n=20)和辐射组(n=60)。辐射组小鼠分别接受3、5、10Gy一次性全身照射，每个剂量组20只，剂量率0.78Gy/min。辐射在第二军医大学60Co源室进行。

1.2 血清样本采集 小鼠在辐射后6h经眼球取血，全血于室温放置1h后，以2500r/min离心，小心吸取上层血清，以50μl/管分装，冻存于－80℃。

1.3 基因芯片细胞因子检测 辐射组小鼠每个辐射剂量取300μl混合血清用于基因芯片检测(15μl/只)，样品量为100μl/次，检测3次，取平均值。细胞因子抗体芯片采用RayBio® Mouse Cytokine Antibody Array C Series 1000(RayBiotech，Inc.，AAMCYT-1000-4)。检测采用双抗体夹心法，通过荧光强度扫描读取数据。

1.4 数据处理 芯片检测数据原始值通过减去远离阳性对照POS的空白对照值做修正，并用阳性对照POS做标准化，计算出标准化值。辐射组标准化值再与对照组比对，得出相应比值，若比值＞1.3或＜0.77，视为表达上调或下调。

2 结 果

2.1 辐射剂量敏感细胞因子筛查 共检测了96种细胞因子。由表1可以看出，当辐射剂量升高时，变化的细胞因子数量增多：当辐射剂量为3Gy时，有34个因子上调，10个因子下调；当辐射剂量为5Gy时，有28个因子上调，19个因子下调；当辐射剂量为10Gy时，有40个因子上调，26个因子下调。其中，与对照组比较，3个剂量辐射均引起表达升高的有：受体酪氨酸激酶(AXL)、B淋巴细胞趋化因子(BLC)、Fas配体(Fas-ligant)、趋化因子Fractalkine、粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、细胞集落刺激因子(G-CSF)、干扰素γ(IFNγ)、细胞间黏附因子(ICAM-1)、白细胞介素7(IL-7)、白介素-17B受体(IL-17BR)、基质金属蛋白酶-3(MMP-3)、骨保护素(osteoporotegerin)、蛋白-基质金属蛋白酶-9(pro-MMP-9)、肿瘤坏死因子相关激活诱导因子(TRANCE)、金属蛋白酶组织抑制剂-2(TIMP-2)、血管内皮细胞生长因子受体3(VEGFR3)。3个剂量均引起表达降低的有：CD40、胸腺表达化学因子(TECK)。此外，还有只对低剂量敏感的细胞因子，如细胞因子反应基因(CRG-2)、趋化因子16(CXCL16)和Ⅱ型可溶性肿瘤坏死因子α受体(sTNFRⅡ)。同样，也存在只对高剂量敏感的细胞因子。当累积剂量≥5Gy时，变化的细胞因子有：CD30T、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、单核细胞趋化蛋白-5(MCP-5)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和胸腺活化调节趋化因子(TARC)、金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)。当累积剂量为10Gy时，变化的细胞因子有：胰岛素样生长因子结合蛋白-5(insulin-like growth factor binding protein，IGFBP-5)、发育受体酪氨酸激酶(Dtk)、Flt-3配体(Flt-3-ligand)、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子(GITR)、重组人胰岛素样生长因子-Ⅱ(IGF-Ⅱ)、干扰素诱导的T细胞趋化因子(I-TAC)、瘦素(leptin)、淋巴细胞趋化因子(lymphotactin)、巨噬细胞源趋化因子(MDC)、MIG、巨噬细胞炎症因子-1α(MIP-1α)、嗜中性粒细胞诱导因子(KC)、干细胞因子(SCF)、脂肪细胞因子(resistin)、胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)、血管内皮生长因子(VEGF)。

2.2 剂量-效应依赖细胞因子筛查 对辐射敏感的细胞因子进一步分析表明，有14种细胞因子表达呈剂量-效应依赖，其中7种细胞因子随辐射剂量上升表达上调，7种细胞因子随辐射剂量升高表达下调(图1)。提示细胞因子表达量虽然受多方面调控，但辐射所致量效关系仍然存在。

表1 电离辐射剂量敏感细胞因子Tab.1 Cytokines sensitive to ionizing radiation dose

图1 辐射剂量-效应依赖细胞因子Fig.1 Ionizing radiation dose-effectiveness-dependent cytokines

3 讨 论

电离辐射导致的机体损伤由大量的分子事件组成，在这一复杂的反应网络中，细胞因子起着重要作用。一方面，电离辐射引起的细胞损伤会导致其分泌的细胞因子异常，另一方面，细胞因子的异常分泌又会导致细胞事件的改变，不同的细胞因子与不同的细胞相互作用，就构成了复杂的反应网络。同时，电离辐射剂量也与反应网络的复杂性相关。有研究表明，血清蛋白质及其量的改变与电离辐射剂量相关[3-6]。同样，本研究发现，发生变化的细胞因子种类随辐射剂量增加而增多，当辐射剂量为3Gy时，有44种因子发生变化，当辐射剂量为5Gy时，有47种因子发生变化，而当辐射剂量为10Gy时，有66种因子发生变化。所以，电离辐射剂量与细胞因子变化的数量密切相关。

当然，电离辐射诱导的细胞因子变化是有规律可循的。有研究指出，在10Gy辐射情况下，大脑中TNF-α和TGF-β1在12h内呈现持续下降，而12h后，又逐渐升高；而IL-1在辐照后8h出现上升峰值，随即含量下降，这能很好地反映大脑的急性损伤过程[7]；Singh等[8]报道了小鼠全身辐射后4、24h时细胞因子的变化情况，发现脾脏中G-CSF、GMCSF、IFN-γ、TPO、IL-2、IL-3、IL-6、IL-10和IL-12升高，骨髓中GM-CSF、IFN-γ、TPO、IL-3和IL-10升高。本研究发现，包括AXL在内的16种因子在不同剂量电离辐射作用后表达均升高，CD40、TNF-α和TECK在不同剂量电离辐射作用后表达均下降。进一步研究还发现，有14种细胞因子的表达呈剂量-效应依赖，其中7种细胞因子随剂量上升表达增高，7种细胞因子随剂量升高表达下调。

细胞因子的规律性变化常常用于辐射后机体或脏器损伤的评估，例如TGF-β1、IL-6、KL-6、表面活性蛋白和IL-1α可很好地预测肺部化疗患者肺急性损伤的程度[9-11]。当然，每个组织内细胞因子的变化不仅是预测损伤的重要依据，同时，它们随辐射剂量而改变的特性也可作为判断辐射剂量的重要依据。从总体来看，细胞因子变化数量越多，辐射剂量越大。同时，本研究通过抗体芯片筛查还发现，细胞因子的变化规律各不相同。其中，有仅对高剂量(10Gy)敏感的，也有仅对低剂量(3Gy)敏感的，利用这些特异的细胞因子变化规律可以初步区分辐射累积剂量的高低。当然，也存在对所有剂量都敏感，其变化存在剂量-效应关系的细胞因子，充分利用其剂量依赖的变化规律，能进一步确定受照剂量。

总之，本研究利用基因芯片技术筛查和分析了不同电离辐射剂量导致的血清中细胞因子的变化及其规律，进一步研究和验证这些细胞因子的变化规律，不仅有利于评估电离辐射的损伤程度，还有利于估算电离辐射的剂量。

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Screening of cytokines associated with ionizing radiation dose in serum by cytokine array

LIU Qiong, HE Ying, SHEN Xian-rong*, MO Lin-fang, WANG Qing-rong, CHEN Wei, JIANG Ding-wen, HOU Dengyong, HE Xiao-yi, QIAN Tian-tian, LIU Yu-ming, LI Ke-xian
Radiation Effect and Protection Laboratory, Naval Medical Research Institute, Shanghai 200433, China
*

, E-mail: xianrong_sh@yahoo.com
This work was supported by the Grants from Medical Guide Project of Shanghai Municipal Science and Technology Commission (10411969300), the “Eleventh Five-Year” Tackle Key Problems in Science Technology of General Logistics Department of PLA (08G037), the Science Technology Program of the General Logistics Department of PLA (AHJ09J012), and the Shanghai Municipal Health Bureau Scientific Research Fund Project (20124435)

ObjectiveTo identify the cytokine biomarker candidates in serum associated with ionizing radiation dose, and analyze the patterns of them by cytokine antibody array.MethodsEighty male C57BL/6 mice were randomly divided into radiation group (n=60) and control group (n=20). Mice in radiation group were treated with60Co total-body irradiation with the dose of 3, 5 and 10Gy, respectively (20 each dose group). Six hours after radiation, blood was obtained from the orbital sinus bleeding, and serums were collected. The serum cytokine concentration was analyzed by antibody array of 96 mouse cytokines, and cytokine biomarker candidates which were shown to be dose-responsive to ionizing radiation had been identified. ResultsInterestingly, the majority of the 96 mouse cytokines showed positive changes in amounts of cytokine. Following ionizing radiation exposure, only 44 cytokines changed at the expose dose of 3Gy, while 47 cytokines changed at the dose of 5Gy and 66 cytokines at the dose of 10Gy. Further analysis revealed that 14 cytokines were shown to be dose-responsive to ionizing radiation. Among those, 7 cytokines were shown up-regulated in a dose-dependent trend in response to ionizing radiation, and 7 cytokines were shown downregulated.ConclusionThese serum cytokine biomarkers which are sensitive to ionizing radiation may act in a dose-dependent manner, suggesting that the serum cytokine biomarker candidates can be used for estimating dose of ionizing radiation.

radiation, ionizing; cytokines; radiation dosage

R144.1

A

0577-7402(2013)10-0822-04

10.11855/j.issn.0577-7402.2013.10.008

2013-05-29；

2013-08-13)

(责任编辑：李恩江)

上海市科学技术委员会医学引导类科研项目(10411969300)；总后“十一五”科技攻关项目(08G037)；总后科研项目(AHJ09J012)；上海市卫生局项目(20124435)

刘琼，理学博士，助理研究员。主要从事辐射防护方面的研究

200433 上海 海军医学研究所防护医学研究室(刘琼、何颖、沈先荣、莫琳芳、王庆蓉、陈伟、蒋定文、侯登勇、何晓义、钱甜甜、刘玉明、李珂娴)

沈先荣，E-mail: xianrong_sh@yahoo.com