李秀霞，孙协军，冯彦博，李 娇，励建荣

（渤海大学化学化工与食品安全学院，辽宁锦州121013）

凌枣又称铃枣，其果树耐寒、抗贫瘠，适应性强，是辽西地区的特色栽培品种，主要分布在辽宁省凌源市。凌枣果实脆甜，凌枣枣果富含多糖、氨基酸和多种维生素及矿物质，属鲜食品种。有研究表明，凌枣中总黄酮含量为枣果之首[1]，主要包括芦丁、药黄素和黄酮-C-葡萄糖苷等黄酮类化合物等[2]。这些黄酮类生物活性物质具有很高的营养保健价值，可起到消炎止咳、降血压、降血脂、增进冠状动脉血流量和防治冠心病、心绞痛等作用，经常食用有增进人体健康的功效。对凌枣功能性成分进行开发利用，对于促进凌源枣业的发展和满足人们对天然保健食品的需求具有重要的意义。本实验以辽西凌枣黄酮为研究对象，探讨不同部位凌枣黄酮的含量和抗氧化活性，为凌枣功能性食品的研究和应用开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

凌枣 购于当地市场；芦丁 色谱纯，中国生物制品检定所；2，2-二苯基苦基苯肼（DPPH） 美国Sigma-aldrich公司；邻二氮菲 天津市大茂化学试剂厂；焦性没食子酸 国药集团化学试剂有限公司；三氟乙酸 天津大茂化学试剂厂；其他试剂 均为分析纯。

P680型液相色谱仪 美国戴安公司；AD双反型超纯水机 上海讯辉环保科技有限公司；TU1901型紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器公司；A-2004型电子分析天平 上海恒平科学仪器有限公司；RE-2000型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；SHZ-D（Ⅲ）型循环水真空泵、101B-2型电热鼓风干燥箱 上海申光仪器仪表有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 芦丁标准溶液的配制 以甲醇为溶剂配成质量浓度为1g/L的芦丁对照品贮备液，使用时分别稀释成系列浓度：0.02、0.06、0.10、0.20、0.50、1g/L。

1.2.2 色谱条件 参照彭艳芳[2]枣果芦丁HPLC分析方法进行，有所改动，具体条件为流动相及比例：甲醇/水（80∶20，v/v），流速：1.0mL/min，进样量：20μL，柱温：40℃。

1.2.3 待测样品的制备

1.2.3.1 凌枣预处理 选择饱满完整的凌枣分为3份，用冷水冲洗，去除凌枣表面附着的尘土、泥沙，水蒸汽蒸30min后立即放入冷水中浸泡、剥皮。凌枣果皮、果肉、果核及全枣分别于65℃电热鼓风干燥箱内烘干，粉碎机粉碎，过40目筛后装袋密封，置于干燥器中贮存备用。

1.2.3.2 凌枣黄酮提取方法 准确称取干燥至恒重的枣粉1.000g置于250mL圆底烧瓶中，加入一定体积和浓度的乙醇溶液，在设定温度恒温水浴中加热回流提取一定时间后抽滤，收集滤液并蒸干溶剂后，用30%乙醇溶液定容至刻度，即为待测液。

1.2.3.3 黄酮得率的计算 以提取液黄酮得率作为考查指标，黄酮得率计算式为：S（%）=cv/m×100

式中：S—黄酮得率，mg/g；c—提取液芦丁含量，mg/mL；v—提取液定容体积，mL；m—枣粉质量，g。

1.2.4 还原力测定 参照Oyaizu和荣建华等的方法[3-4]。取2.0mL不同浓度的样品（2～50mg/mL）或抗坏血酸溶液（标准参照物），加入2.0mL pH6.6的磷酸盐缓冲液（0.2mol/L）和2.0mL 1%（w/v）的铁氰化钾溶液，混匀，在50℃保温20min后迅速冷却，向混合液中加入2.0mL 10%（w/v）的三氯乙酸溶液，混匀后以655.2×g离心10min。取上清液2.5mL，加入2.5mL蒸馏水和0.5mL 0.1%（w/v）的三氯化铁溶液，然后在700nm波长下比色，以水为空白。吸光值越大，则样品的还原力越强。

1.2.5 清除羟自由基能力的测定 以邻二氮菲-亚铁化学法测定羟自由基能力清除能力[5]。取7.5mmol/L邻二氮菲溶液1mL置于试管中，依次加入0.2mol/L的pH7.40磷酸缓冲液2mL和样品液1mL，充分混合后，加入0.75mmol/L硫酸亚铁液1mL，混匀，加入1mL 0.01% H2O2，于37℃下温育60min，于536nm测其吸光度值，记为AS。用1mL蒸馏水代替1mL H2O2，测得的吸光度称AB。空白管以1.00mL蒸馏水代替1.00mL样品作为参照，测得的吸光度为AP，羟自由基清除能力按以下公式计算：

1.2.6 清除DPPH自由基能力测定 参照Suda描述的方法进行测定[6]。利用DPPH溶液的特征紫红色团的吸收峰，用分光光度法测定加不同浓度的抗氧化剂或样品后在517nm吸收的变化表示其对有机自由基的清除能力。取2.0mL水解液，加入1.0mL 0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.0）和2.0mL 0.2mmol/L DPPH乙醇溶液，混合均匀，于室温下暗处放置20min，然后在517nm下测定其吸光值，自由基DPPH的清除能力以清除率计算：

式中：A1—DPPH溶液+样品溶液的吸光度；A2—DPPH溶剂+样品溶液的吸光度；A0—DPPH溶液+样品溶剂的吸光度。

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线的建立及凌枣黄酮的色谱分离结果

经紫外可见光分光光度计扫描，甲醇溶液中芦丁标准品最大吸收波长为360nm，因此，选择检测波长为360nm。凌枣全枣粉中主要的黄酮类组分为芦丁（见图1）[2，7]，图2为芦丁标样的液相色谱图。由色谱工作站处理数据，以峰面积-质量浓度作图（图形未给出），以芦丁峰面积X为横坐标，相对应的质量浓度Y（g/L）为纵坐标，得到芦丁标准曲线为：Y=0.0019X-0.0031，R2=0.9995，线性区间为0.02～1.00g/L，按3倍信噪比（N/S）计算，芦丁的检出限为：0.23μg/L。

图1 凌枣全枣黄酮提取液色谱图Fig.1 Chromatogram of flavonoid extract from entire ling jujube

图2 芦丁标样色谱图Fig.2 Chromatogram of rutin standard

2.2 凌枣黄酮提取实验结果

以75%的乙醇溶液作提取剂，在提取温度65℃，提取时间1.5h，液固比30∶1（mL/g）条件下，提取不同部位凌枣黄酮并测定含量，测得结果表明凌枣去核全枣、枣肉、枣核和枣皮芦丁含量分别为（3.60±0.32）、（3.85±0.27）、（0.40±0.05）、（3.50±0.65）mg/g，凌枣枣肉和枣皮中黄酮含量稍高于枣核，考虑去核全枣原料丰富易得，并易于处理，以下提取参数优化实验均以凌枣去核全枣（简称凌枣）为原料来进行。

2.2.1 提取剂浓度对凌枣黄酮得率的影响 固定提取温度65℃，提取时间1.5h，液固比30∶1（mL/g），考查提取剂浓度对凌枣黄酮得率的影响。实验结果如图3所示，随着乙醇浓度增大，黄酮得率增加。当提取剂浓度为80%时提取量最大，提取效果最好，其后浓度升高，提取量反而下降。其原因可能是当提取剂浓度超过80%时，凌枣全枣粉中一些杂质随之溶出，对提取过程产生了干扰，从而使黄酮得率下降，因此选用浓度为80%的乙醇浓度进行正交实验。

图3 提取剂浓度对凌枣黄酮得率的影响Fig.3 Effect of extractant concentration on ling jujube flavonoid yield

2.2.2 液固比对凌枣黄酮得率的影响 固定乙醇浓度75%，提取时间1.5h，提取温度75℃，考查液固比对凌枣黄酮得率的影响，实验结果如图4所示。凌枣黄酮得率随液固比增加而增大，当液固比为30∶1～50∶1（mL/g）时黄酮提取效果最好，之后黄酮得率略有降低，这是由于凌枣中黄酮含量有限，当提取溶剂用量达到一定程度后，对黄酮的提取已基本完成，再增加溶剂用量对提取得率没有提高，而且液固比过大增加生产成本，浪费溶剂，并对后续浓缩工作带来较多不便，因此选用液固比30∶1（mL/g）为宜。

图4 液固比对凌枣黄酮得率的影响Fig.4 Effect of ratio of liquid to solid on ling jujube flavonoid yield

2.2.3 提取温度对凌枣黄酮得率的影响 固定乙醇浓度75%，提取时间1.5h，液固比30∶1（mL/g），考查提取温度对凌枣黄酮得率的影响，实验结果如图5所示。提取温度对提取效果影响较大，随着提取温度的升高，凌枣黄酮得率呈逐渐上升趋势，说明温度越高，黄酮在提取剂中的溶解度越大，提取效果越好，同时可初步判断凌枣黄酮耐热性好。75℃时黄酮得率达最大值，到85℃时略有下降，说明凌枣黄酮提取的最适提取温度在75℃左右。一般认为，提取温度是增大得率的有效方式，随着温度的升高，溶剂的分子运动速度加快，渗透、扩散、溶解速度加快，从而使黄酮更易于从枣粉细胞转移至提取溶剂中，但由于温度升高会溶出较多杂质，同样会干扰黄酮的浸出。因此，选择凌枣黄酮的提取温度75℃进行正交实验。

图5 提取温度对凌枣黄酮得率的影响Fig.5 Effect of extraction temperature on ling jujube flavonoid yield

2.2.4 提取时间对凌枣黄酮得率的影响 固定乙醇浓度75%，提取温度75℃，液固比30∶1（mL/g），考查提取时间对凌枣黄酮得率的影响，实验结果如图6所示。凌枣黄酮得率随提取时间的延长而增加，提取时间为1.5h时提取效果最好，之后延长提取时间，提取量增长幅度平缓，说明黄酮提取已基本完成，再延长提取时间对黄酮得率没有大的提高，较长时间的提取会增加能源消耗和生产成本，降低制备效率，故提取时间不宜过长，因此选用提取时间为1.5h。

图6 提取时间对凌枣黄酮得率的影响Fig.6 Effect of extraction time on ling jujube flavonoid yield

2.2.5 正交实验结果 根据单因素实验结果，以乙醇浓度、提取温度、料液比、提取时间为考查因素，选用L9（34）正交表安排设计正交实验，以黄酮得率为考查指标，并对各因素水平结果进行极差分析，得出正交实验结果。依据正交实验结果，确定并验证最佳制备工艺条件。

正交实验设计及结果分析见表1。运用极差进行数据分析处理后得到结果为：RB＞RD＞RC＞RA，即影响凌枣枣肉黄酮类化合物提取效果的因素依次为：液固比＞提取时间＞提取温度＞乙醇浓度，最佳因素水平为A1B2C2D3，即最佳工艺水平为液固比30∶1（mL/g）、提取时间2h、提取温度75℃、乙醇浓度75%。经验证，在此条件下，凌枣粉中黄酮类化合物得率为5.01mg/g。

表1 正交实验设计及结果分析Table 1 Results of extracting orthogonal tests

2.3 抗氧化实验结果

2.3.1 还原力测定结果 还原力测定结果见图7，凌枣黄酮提取液的还原力随着提取液黄酮浓度的增加而增加，可以推测凌枣提取物中的具有电子供体作用的黄酮类物质，通过提供电子而使自由基形成稳定的结构从而终止了自由基的链式反应。在0.15～0.73mg/mL浓度范围内，凌枣不同部位黄酮还原力大小依次为：枣肉黄酮＞全枣黄酮＞枣核黄酮＞枣皮黄酮。

图7 凌枣黄酮和维生素C的还原力测定结果Fig.7 Reducing power of ling jujube flavonoid extract and ascorbic acid

2.3.2 羟自由基清除能力 本实验中，羟自由基是由Fe2+和H2O2反应而产生的，凌枣黄酮含有的酚羟基在反应生成的羟自由基和氧自由基的清除作用中起着氢供体的作用，还原氧化性自由基[8-9]。羟自由基清除率测定结果见图8，在0.29～3.50mg/mL浓度范围内，凌枣各部位黄酮提取液羟自由基清除能力均随着浓度的增加而增大。凌枣不同部位黄酮清除羟自由基能力的顺序依次为：枣肉黄酮＞全枣黄酮＞枣核黄酮＞枣皮黄酮。

2.3.3 DPPH自由基清除能力 DPPH清除能力测定结果见图9，凌枣不同部位黄酮对DPPH自由基的清除能力大小依次为：枣肉黄酮＞全枣黄酮＞枣核黄酮＞枣皮黄酮，综合以上结果，凌枣枣肉中可能含有较高活性或较高含量的活性黄酮组分。

图8 凌枣黄酮和维生素C清除羟自由基的能力Fig.8 Hydroxyl radical scavenging activity of ling jujube flavonoid extract and ascorbic acid

图9 凌枣黄酮和维生素C的DPPH自由基清除能力Fig.9 DPPH scavenging activity of ling jujube flavonoid extract and ascorbic acid

3 结论

对凌枣黄酮回流提取工艺进行了优化，得到最佳工艺条件为：液固比30∶1（mL/g）、提取时间2h、提取温度75℃、乙醇浓度75%。在此条件下，凌枣枣肉黄酮得率为5.01mg/g。凌枣不同部位黄酮还原力和羟自由基及DPPH自由基清除能力顺序均为：枣肉黄酮＞全枣黄酮＞枣核黄酮＞枣皮黄酮，说明凌枣枣肉中含有较高活性或较高含量的黄酮类物质。

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