黄酒酿造过程细菌群落结构变化初步研究

2013-08-07栾同青李志军钟其顶熊正河李敬龙

食品工业科技 2013年12期

栾同青，李志军，钟其顶，孟镇，熊正河，*，李艺，李敬龙

（1.山东轻工业学院食品与生物工程学院，山东济南250353；2.中国食品发酵工业研究院，北京100027；3.全国食品发酵标准化中心，北京100027；4.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457）

黄酒是中国的传统酒种，其风味物质及有害物质的生成与发酵过程微生物菌群结构密切相关[1]。黄酒酿造过程微生物种类和数量繁多，细菌群落结构和相互作用机理复杂，以往的研究多是采用传统平板对黄酒麦曲中的细菌进行分离并鉴定，不能快速、全面分析出细菌群落的整体结构，而与传统方法相比，分子生物学技术在研究微生物多样性方面具有明显的优势。近年来，很多学者利用PCR-DGGE技术对不同样品进行了微生物多样性分析，包括对土壤[2]、活性污泥[3-4]、大酱[5]、饮用水[6]、白酒大曲[7]、糟醅[8]、酒醅[9]和肠道菌群[10]等样品的研究，结果表明，该技术在揭示环境微生物多样性、种群差异等方面具有一定优越性。截至目前，尚未见采用PCR-DGGE技术研究黄酒酿造过程中细菌群落结构变化的报道，本文采用该技术初步研究了黄酒工业化生产条件下浸米水、麦曲和酒母及发酵过程中的细菌群落结构组成及变化情况，为进一步研究细菌对黄酒风味物质的影响和黄酒质量安全问题奠定了一定的基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

一个完整酿造流程中的浸米水、麦曲、酒母、前酵液（前酵第1、2、3、4d样品）、后酵液（后酵第3、6、9、13、16d样品）浙江某黄酒厂；引物：F338GC/R518（F338GC：5’-CGCCCGGCCGCGCGCGGCGGGCGGGG CGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGAGGCAGCAG-3’、下划线部分为GC夹、518R：5’-ATTACCGCGGCT GCTGG-3’）、F338/R518、M13F/M13R（M13F：5’-TG TAAAACGACGGCCAGT-3’、M13R：5’-CAGGAAACA GCTATGACC-3’、dNTPs、X-gal、IPTG 上海生工生物工程技术服务有限公司；TransTaqTM HiFi DNA Polymerase、DNA纯化试剂盒、pEASY-T3 Cloning Kit、Trans1-T1 北京全式金生物科技有限公司；溶菌酶、蛋白酶K、SDS 北京全新拓达科技有限公司；去离子甲酰胺、丙烯酰胺、双丙烯酰胺、N，N，N’，N’-四甲基二乙胺 Sigma公司。

恒温生化培养箱上海一恒科技有限公司；高速冷冻离心机 Sigma公司；梯度PCR仪 Biometra公司；水平电泳仪北京六一仪器厂；凝胶成像仪 Vilber lourmat公司；变性梯度凝胶电泳仪 Bio-Rad公司。

1.2 实验方法

分别称取3g浸米水、麦曲、酒母、前酵液（1、2、3、4d）和后酵液（3、6、9、13、16d）样品，采取文献[11]方法提取本实验样品基因组DNA。采用降落PCR法对提取DNA的16S rDNA V3区进行扩增，扩增产物进行DGGE实验，最后进行连接转化，送交测序公司测序。

2 结果与分析

2.1 DGGE图谱分析

图1为黄酒酿造过程不同样品的细菌DGGE图谱。DGGE电泳图谱中不同位置的条带代表了不同种属的细菌；条带的亮度反映了该细菌的丰度，条带越亮，表明该细菌的相对含量可能越大。由图1可以看出，各样品的电泳条带分离效果较好，条带亮度各有不同，A、C、D、G为所有样品共有条带；浸米水样品D条带代表的细菌含量相对最丰富，并含有其他样品不存在的细菌I和细菌J；麦曲样品条带较为繁杂，条带G和K代表的细菌含量相对丰富；酒母与前酵液样品条带较相似；后酵液各阶段样品条带较相似，且D、E、F条带代表的细菌含量随发酵时间呈逐渐升高趋势。细菌G存在于黄酒酿造全过程，是发酵过程中的主要优势菌。图1显示，发酵液样品中至少含有14个清晰条带，这表明在发酵过程中存在较高的细菌多样性。图2为黄酒酿造过程不同样品之间细菌群落结构组成的相似度。由图2可以看出，前酵样品之间较为相似，后酵样品之间较为相似，前酵样品与后酵样品之间存在较大差异，相似度仅为58%。

图1 黄酒酿造过程细菌DGGE图谱Fig.1 The DGGE profile of the bacteria during the rice wine fermentation process

图2 黄酒酿造过程不同样品间细菌群落结构组成的相似度Fig.2 The similarity of bacterial community structure between different samples during the rice wine fermentation process

为进一步分析黄酒酿造过程细菌群落结构变化，利用Quantity one等软件对DGGE图谱进行Shannon指数（H’）分析，评估样品中细菌的多样性；微生物区系菌群均匀度（E）分析，评估某一样品中各细菌分布的均匀情况，结果见表1。

由图1和表1可以看出，黄酒酿造过程细菌的多样性随着酿造时间的延续呈现先升高，而后逐渐稳定的趋势，细菌种类增加，细菌总量分布趋于均匀。浸米水中细菌多样性相对较低，细菌总量分布不均，D条带代表的细菌总量较为丰富；麦曲和酒母的细菌多样性较为复杂；前酵过程细菌多样性基本呈现上升趋势，细菌种类在逐渐增加，但均匀度变化不大；后酵开始阶段细菌种类较多，而后呈现平稳趋势。

表1 黄酒酿造过程细菌群落结构分析Table 1 Analysis of the changes of bacterial community structure during the rice wine fermentation process

2.2 酿造过程细菌群落多样性分析

为进一步探明黄酒酿造过程细菌群落结构的多样性，对DGGE图谱中的条带进行切胶回收、克隆转化、蓝白斑筛选和阳性克隆验证等一系列操作后进行测序，将测序得到的目的序列，通过NCBI进行同源性搜索以及相关信息检索，与数据库中已有序列进行比对。结果显示，黄酒酿造过程中存在乳杆菌（Lactobacillus）、葡萄球菌（Staphylococcus）、糖多孢菌（Saccharopolyspora）、肠杆菌（Enterobacteriaceae）、布丘氏菌（Buttiauxella）和不可培养细菌（Uncultured bacterium）等种类，见表2。此结果与张中华等[12]检测的黄酒麦曲中的细菌群落结构相似，都检测到含有Saccharopolyspora和Enterobacteriaceae，此外还检测到了Lactobacillus和Staphylococcus，但未检测出致病菌Clavibacter michiganensis；本实验检测出三株乳杆菌，与章银珠等[13]运用传统培养基法在黄酒中检测出较多的乳酸杆菌结果相似。由图1可见，Lactobacillus pentosus strain和Saccharopolyspora sp.由麦曲带入发酵液，且在后酵阶段含量较为丰富，Lactobacillus coryniformis strain由酒母带入发酵液，且在前酵阶段含量相对丰富。在黄酒发酵过程中含有较多的乳酸菌A、B、E，并检测到了不可培养细菌F、G、J，其中，不可培养菌G还是发酵过程中的优势菌群。

黄酒的酿造流程分为浸米、蒸米、摊凉、前酵、后酵和过滤煎酒等过程，麦曲和酒母在大米摊凉后与原料一起进入发酵过程。黄酒酿造过程细菌的多样性呈现先上升后平稳的趋势，原因可能是前酵过程发酵温度高（26～34℃）、营养物质和氧气充足、酒精度相对较低（由0°增长至14°左右），适宜微生物的大量繁殖；后酵过程实行控温发酵，发酵温度低（15℃左右）、酒精度较高（后酵结束增长至17°左右）、pH偏低（3.0～4.0），大部分微生物的繁殖受到抑制[14-16]。Lactobacillus plantarum strain（A）、Staphylococcus sp.（C）和Enterobacteriaceae bacterium（D）等属于需氧或兼性厌氧菌，前酵过程的发酵条件适宜它们的生长，在大量繁殖后进入后酵过程而趋于平稳。Lactobacillus pentosus strain（B）等属于厌氧型细菌，且具有较强的耐酸能力，其在后酵过程含量较为丰富。Saccharopolyspora sp.（K）等菌在前酵过程含量较为平稳，进入后酵过程后，其含量逐渐降低，可能是后酵过程的低温、高酒精度和低pH导致了它们的衰退。

研究表明，在黄酒酿造过程中乳杆菌（Lactobacillus）可以产生乳杆菌素，对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌、假单胞菌和黄曲霉具有一定的抑制作用[17-18]，何煜波等[19]对Lactobacillus plantarum的基本性状进行了研究，结果表明该菌对金黄色葡萄球菌和沙门氏菌具有一定的抑制作用；祝嫦巍等[20]对Lactobacillus pentosus研究发现，其不仅对革兰氏阳性菌有抑制作用，而且对沙门氏菌等革兰氏阴性菌也有一定的抑制作用；陈坚等[21]筛选出一株抑制生物胺产生的Lactobacillus coryniformis，该菌产生的细菌素具有较广的抑菌谱。糖多孢菌（Saccharopolyspora）是寻找新的生物活性物质的重要菌源，某些种能产生重要的生物活性物质，如抗生素、酶类、维生素等，红色糖多孢菌具有产红霉素的能力[22]。布丘氏菌（Buttiauxella izardii）具有产植酸酶的能力，2009年丹尼斯科美国公司公布了一种可以应用于植酸酶工业生产的布丘氏菌[23]。

图3 系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree

表2 DGGE条带序列分析Table 2 Sequence analysis of DGGE bands

用软件MEGA5对测序结果和GenBank中相关种属代表菌株的16S rDNA序列构建系统进化树，结果如图3所示。由图3可以看出A、B、C三种菌的亲缘关系较近，D、E、I、J四种菌的亲缘关系较近，H、K两种菌的亲缘关系较近，不可培养菌F、G与其他菌的亲缘关系较远。

3 结论

本文采用PCR-DGGE技术对黄酒酿造过程的浸米水、麦曲、酒母、前酵液和后酵液进行分析，以研究黄酒酿造过程细菌群落结构的变化。研究结果显示，黄酒酿造过程细菌的多样性呈现先上升后平稳的趋势，原因可能与黄酒酿造过程不同阶段的环境条件有关。浸米水细菌群落结构相对简单，麦曲细菌群落结构较为复杂，前酵样品与后酵样品之间细菌群落结构存在较大差异，相似度仅为58%。

黄酒酿造过程中存在乳杆菌（Lactobacillus）、葡萄球菌（Staphylococcus）、糖多孢菌（Saccharopolyspora）、肠杆菌（Enterobacteriaceae）、布丘氏菌（Buttiauxella）和不可培养细菌（Uncultured bacterium）等种类。浸米水中存在独有的Buttiauxella和Uncultured bacterium；麦曲中Saccharopolyspora含量丰富；前酵和后酵样品中Enterobacteriaceae和Uncultured bacterium含量相对丰富。

本研究从黄酒酿造过程中检出多株乳杆菌，说明乳杆菌对黄酒的发酵具有相对较大的影响，此外还检出了不可培养的优势菌，其在黄酒酿造过程中的作用有待进一步研究和验证。

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