熊 强，杨青丽，韩 浩

（南京工业大学生物与制药工程学院，南京211800）

人源双歧杆菌的分离纯化及鉴定

熊 强，杨青丽，韩 浩

（南京工业大学生物与制药工程学院，南京211800）

利用改良的乳酸细菌（MRS）培养基从健康人群的粪便中进行双歧杆菌的分离筛选。结果表明：在添加有5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-Gal）的MRS培养基上双歧杆菌的菌落呈典型的乳白色并带有蓝色，其他菌株的菌落呈白色或深蓝色。实验共分离出10株疑似菌株，经生理生化试验和Biolog自动微生物分析系统鉴定，结果发现其中4株为双歧杆菌，这4株菌中有3株为两歧双歧杆菌，1株为长双歧杆菌。和传统MBS培养基相比较，改良MRS培养基能显著提高筛选效率。

双歧杆菌；鉴定；分离；MRS培养基

双歧杆菌是1899年巴斯德研究院的Tissier博士首先在以母乳喂养的婴儿粪便中发现并分离出来的［1］，它是常见的人体肠道菌群中的重要成员［2］，具有维护肠道生态平衡、抗菌、增强免疫功能和抗肿瘤等多种生物学功能［3-4］。近年来，随着人民健康意识的不断提升，双歧杆菌在保健食品的应用也越来越广泛。但是由于双歧杆菌是严格厌氧菌，对营养条件要求特别苛刻［5］，在和其他肠道细菌共存的条件下分离比较困难。

笔者通过在乳酸细菌（MRS）培养基中添加不同的物质，选择性抑制一些肠道细菌，并根据双歧杆菌的菌落形态和色泽达到双歧杆菌快递分离和筛选的目的，以期为以后的科研和生产构建良好的种质资源基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 试样来源

新鲜粪便：采自南京工业大学的健康学生。

1.1.2 培养基

缓冲蛋白胨水溶液［6］（1 L）：蛋白胨10 g，NaCl 5 g，Na2HPO42 g，KH2PO42 g。

MRS固体培养基（1 L）：胰蛋白胨5 g，酵母浸出粉5 g，柠檬酸铁铵2 g，乙酸钠5 g，Na2HPO42 g，MnS04·H2O 0.05 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，葡萄糖15 g，乳糖5 g，L-半胱氨酸盐酸盐0.5 g，吐温-80 1 mL，琼脂25 g。调pH 6.7，121℃灭菌15 min。

改良MRS固体培养基：在MRS培养基的基础上分别添加5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-Gal）0.06 g／L，LiCl 4 g／L。

1.1.3 仪器设备

YOX-Ⅱ型厌氧培养箱（上海新苗医疗器械制造有限公司），SW-CJ-1FD型超净台（苏州安泰空气技术公司），YXQ-LS-50S11型灭菌锅（上海博迅实业有限公司医疗设备厂），Biolog全自动微生物鉴定仪（美国Biolog公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 试样的采集与处理

用灭菌竹签迅速挑取新鲜的人体粪便少许，放入已灭菌好的装有9 mL的缓冲蛋白胨水溶液的试管中，充分振荡摇匀，制备菌悬液，然后用无菌缓冲蛋白胨水溶液进行梯度稀释至10-7。

1.2.2 双歧杆菌的分离和筛选

取适宜的连续3个梯度的稀释液各1 mL分别注入无菌平皿中，倾注法制备平板，每个稀释度2块平皿，待冷却后立即放入厌氧培养箱中37℃倒置培养48～72 h。根据菌落形态结合革兰氏染色结果，对双歧杆菌疑似菌株进行进一步的划线分离，重复划线转接，直至获得镜检纯的菌株为止。

1.2.3 双歧杆菌的鉴定

首先对筛选出的双歧杆菌疑似菌株进行需氧性鉴定，然后对需氧性鉴定阴性菌株进行接触酶试验、甲基红试验、吲哚试验、V.P.试验、硝酸盐还原试验、明胶液化试验、脲酶试验，淀粉水解试验［7］。在上述试验的基础上，利用Biolog自动微生物分析系统进行鉴定［8］。

2 结果与讨论

2.1 菌落及菌落形态的观察

对筛选得到的菌株在MRS培养基上进行培养，结果发现不同菌株的菌落形状不同、大小不一，有白色和淡黄色2种，挑取圆形表面光滑的白色菌落进行染色，镜检后可以看到菌株有革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，呈球形、杆状、细长状等多种形态，经反复划线后仍然难以得到纯培养物，镜检观察仍有革兰氏阴性菌存在，双歧杆菌的分离比较困难。

在改良MRS培养基上可以看到平板上菌落形态各异。菌落色泽主要有白色、蓝色底蕴乳白色菌落、蓝色菌落3种，形态为凸状、圆形且表面光滑。分别挑取3种不同颜色的菌落进一步划线分离。结果发现：有蓝色底蕴乳白色菌落的菌体特征比较符合双歧杆菌的形态特征，这与长双歧杆菌在该培养基上的菌落形态、颜色（图1）基本一致，且有比较明显的V型、Y型和棒状（图2），以革兰氏阳性菌居多；但是白色菌落和蓝色菌落的菌体以直杆状、球形的为主，且革兰氏阴性菌较多，不符合双歧杆菌的特性。这说明在MRS培养基上添加X-Gal可以提高双歧杆菌的筛选效率。最终，从25份健康学生的粪便中共获得10株双歧杆菌的疑似株（编号分别为B3、B4、B6、B8、B13、B17、B19、B20、B23和B24）。

图1 长双歧杆菌在改良的MRS培养基上的菌落形态Fig.1 Colony morphology of B．longum on improved MRSmedium

图2 双歧杆菌疑似菌株的菌体形态（×1 000）Fig.2 Cellmorphology of candidate Bifidobacterium（×1 000）

本试验的目的是从健康人的肠道中获得双歧杆菌，由于健康人的肠道中有大量的微生物，因此从成人粪便中分离双歧杆菌相对比较困难。常规方法所使用的MRS培养基对目的微生物的鉴别能力不强，造成筛选的效率不高。笔者在MRS培养基中添加LiCl（4 g／L）和X-Gal（0.06 g／L），能有效提高培养基对双歧杆菌的鉴别能力。一方面，添加的LiCl可以抑制大肠杆菌和乳酸菌的生长［9］，选择性抑制杂菌的干扰；另一方面可以根据菌落的颜色方便快捷地筛选到目的微生物。多数双歧杆菌和乳酸菌在生长中均能产生半乳糖苷酶，使底物X-Gal分解，释放出吲哚从而使菌落显色，不同菌种由于半乳糖苷酶的活力不同而使菌落呈现不同的色泽［10］，依此可作为鉴别依据。双歧杆菌的菌落呈乳白色带有蓝色，这与江晓等［11］所报道的文献结果一致，而与孙雪等［12］和刁治民等［13］所报道的文献不一致，这可能是因为所选的培养基不一样。孙雪等［12］在NPNL培养基上双歧杆菌的菌落亦呈深蓝色；刁治民等［13］在改良的MRS培养基中添加X-Gal，双歧杆菌菌落呈深蓝色，从而呈现不同的结果。造成上述颜色反应不一致的原因也可能和分离的手段有关，如涂布接种和倾注接种对菌落的色泽有一定的影响。

2.2 生理生化试验结果

10株双歧杆菌疑似菌株进行生理生化试验鉴定，结果发现B8和B19在厌氧和有氧条件下均能生长，因此淘汰这2株菌，对剩余8株菌的进一步进行生理生化试验，结果见表1。

表1 菌株的生理生化试验结果Table 1 Results of physiological and biochem ical tests on the candidate Bifidobacterium

由表1可知：B3，B6这2株菌株不是双歧杆菌，其余的均可以初步断定是双歧杆菌。

2.3 Biolog自动微生物分析系统的鉴定结果

对初步确定为双歧杆菌的菌株利用Biolog自动微生物分析系统进行进一步鉴定。在Microlog应用程序中选择的培养时间20～24 h，鉴定板类型AN，菌株类型AN⁃GP。鉴定结果见表2。

表2 利用Biolog自动微生物分析系统进行菌株鉴定的结果Table 2 Results of the Biolog automated m icrobial analysis system on candidate Bifidobacterium

由表2可知：菌株B4，B17和B23为两歧双歧杆菌（图3），B20为长双歧杆菌（图4），而B13未鉴定出，说明该菌株不是双歧杆菌，而B24的相似度低于0.5，可靠性很低，无法判断其是否是双歧杆菌，可利用16S rDNA等分子生物学手段进一步鉴定。

图3 两歧双歧杆菌的菌体形态（×1 000）Fig.3 Cellmorphology of B．bifidum（×1 000）

由于双歧杆菌菌体形态的不稳定，同一菌株在生长的不同时期或不同条件下也可能显现不同的形态［14］，而且经过多次传代培养后革兰氏染色将会从阳性转变为阴性［13］，因此菌株在初次分离时菌体有比较明显的V型、Y型和棒状，多次传代后菌体的形态变为较小的、弯曲的杆状，有些菌株的革兰氏染色结果甚至显示为阴性。此外，由于双歧杆菌在实验室传代的过程中不能保证严格的厌氧条件，野生菌株在人工培养条件下可能发生一定的变异，因此在利用Biolog全自动微生物分析系统鉴定双歧杆菌前应严格控制传代次数，且应注意接种好的鉴定板在培养时厌氧环境中不能含H2，否则会影响实验结果的准确性。

图4 长双歧杆菌的菌体形态（×1 000）Fig.4 Cellm orphology of B．longum（×1 000）

3 结 论

利用改良的MRS培养基从健康人的肠道中筛选得到10株双歧杆菌疑似菌株，经生理生化和Biolog自动微生物分析系统鉴定，3株为两歧双歧杆菌，1株为长双歧杆菌。和传统MRS培养基相比较，改良MRS培养基能显著提高筛选的效率。

［1］ 汪雪雁.双歧杆菌的研究进展［J］.安徽农业大学学报，2000，27（2）：175⁃177.

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The identification of Bifidobacterium form human feces

XIONG Qiang，YANG Qingli，HAN Hao

（College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing University of Technology，Nanjing 211800，China）

A Bifidobacterium strain was separated and raised from the excrement of the healthy adults，using the improved MRSmedium.The result showed that the colors were different on the MRSmedium with X⁃Gal，and the Bifidobacterium colonies were milky white with blue background，while other strain colonieswerewhite and dark blue.According to the results of physiological tests and the Biolog automated microbial analysis system，4 strains of Bifidobacterium from 10 were identified，3 strains were B．bifidum and the other was B．longum.Meanwhile，the research results showed that，compared with the MBS medium，the improved MRSmedium could significantly enhance the separation efficiency.

Bifidobacterium；identification；isolation；MRSmedium

S852.6

A

1672-3678（2013）06-0038-04

10.3969／j.issn.1672-3678.2013.06.008

2013-01-05

国家重点基础研究发展计划（973计划）（2011CB200906）

熊 强（1970—），男，江苏南京人，副教授，研究方向：微生物与发酵工程，E⁃mail：xiongqiang＠njut.edu.cn