张 矫，崔文静，马祥敏，王雯雯，王 欣

(天津医科大学附属肿瘤医院，乳腺癌防治教育部重点实验室，天津市肿瘤防治重点实验室，天津300060)

蛋白质的反式剪接是一种翻译后蛋白质的成熟过程，即介于中间的多肽序列(内含肽)自动催化将其本身从蛋白质前体中切除，伴随形成肽键连接两端的侧翼序列(外显肽)，形成成熟有功能的蛋白。这种反式剪接广泛应用于蛋白选择性化学修饰、同位素探针标记等生物技术领域［1］。目前，来源于Synechocystis sp．strain PCC6803的天然剪接内含肽DnaE基因(Ssp DnaE)已得到广泛应用。然而，Ssp DnaE在哺乳动物细胞37℃培养条件下剪接能力差，不能达到理想的实验研究要求［2，3］。2012 年 9月～2013年3月，我们应用一种来源于 Nostoc punctiforme PCC73102的内含肽DnaE基因(Npu DnaE)，并通过哺乳动物细胞实验，证实其具有高效的蛋白剪接效率，为其研究与应用提供理论依据。

1 材料与方法

1．1 材料 Phusion Hot StartⅡ DNA polymerase、Pierce BCA Protein Assay Kit蛋白浓度检测试剂盒购自Thermo公司;限制性内切酶 EcoRI、BamHI购自Fermentas公司;琼脂糖凝胶回收试剂盒、In-fusion连接酶、Ecoli DH 5α菌株、质粒提取试剂盒均购自Takara公司;DMEM培养液购自Neuron-biotech公司;胎牛血清(FBS)购自兰州民海生物工程有限公司;Anti GFP-Tag鼠源单克隆抗体及Anti c-myc-Tag鼠源单克隆抗体购自天津三箭生物技术有限公司。293T细胞系、黄色荧光蛋白 Venus质粒、pCDHCMV-MCS-EF1-Puro载体为天津市肿瘤医院肿瘤细胞生物学实验室已有资源。Npu DnaE cDNA由GENEWIZ公司合成(合成时在N片段末尾加入myctag，方便剪接后的抗体检测)。

1．2 方法

1．2．1 引物设计方法 根据 NCBI提供的 Npu DnaE、Venus基因信息设计引物，将Venus的N片段(1～154氨基酸)与Npu DnaE的N片段(1～102氨基酸)连接，构成融合基因 Vn-NDn-myc，与pCDHCMV-MCS-EF1-Puro载体相连。引物设计……