郝 林姜 波韩从辉庞 慧何厚光付 昱张俊杰张培影*

（1 徐州市中心医院泌尿外科，江苏 徐州 221009；2 徐州市中心医院中心实验室，江苏 徐州 221009）

苦瓜MAP30基因克隆与鉴定

郝 林1姜 波1韩从辉1庞 慧2何厚光1付 昱2张俊杰1张培影1*

（1 徐州市中心医院泌尿外科，江苏 徐州 221009；2 徐州市中心医院中心实验室，江苏 徐州 221009）

目的 克隆苦瓜Ⅰ型核糖体失活蛋白 MAP30 全长基因并构建其表达载体。方法 提取苦瓜的基因组 DNA，根据 Genebank 中已公开发表的 MAP30 序列，设计出一对特异性引物。采用 PCR 技术，从苦瓜的基因组 DNA 中获得 MAP30 全长序列共 860bp，克隆入 pET-28a （+）载体中，进行酶切及测序鉴定。结果 克隆了 MAP30 全长基因，经测序证实与 Genbank 中收录的 SEA 基因序列同源性达 100%。结论 本研究成功地克隆了 MAP30 全长基因，为进一步研究 MAP30 基因的靶向抗肿瘤研究奠定了基础。

苦瓜Ⅰ型核糖体失活蛋白；载体构建；序列分析

苦瓜（Momordica charantia，MC）为葫芦科苦瓜属植物，是一种药食同源的植物，其根、茎、叶、花、果实、种子皆可入药。具有清热解毒、降低血糖、抗突变、抗HIV、抗肿瘤、抗生育、抗菌、免疫调节等作用。苦瓜的活性成分种类繁多，包括苦瓜Ⅰ型核糖体失活蛋白（MAP30）、三萜类、生物碱类、甾类化合物、糖类、有机酸类及微量元素等。MAP30是苦瓜中相对分子质量为30000的抗获得性免疫缺陷综合征病毒的蛋白质，它属于单链I型核糖体失活蛋白（ ribosome inhibiting protein，RIP）家族[1]，此类蛋白普遍存在于高等植物中，因可使真核细胞核糖体失活而得名，它具有抗病毒、抗肿瘤、抗菌等多种生物活性。由于MAP30抗肿瘤活性强、毒性低，已成为近年抗癌药物研究的热点。本研究克隆苦瓜Ⅰ型核糖体失活蛋白（MAP30）全长基因，为进一步研究MAP30基因片段在抗肿瘤中的作用提供了实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

幼嫩苦瓜1个，大肠埃希菌DH5a和质粒pET-28a（+）为Sangon公司产品。T4DNA连接酶，Taq DNA聚合酶，限制性内切酶BamH I、Xho I均购自Takara公司，质粒小量提取试剂盒购自Invitrogen公司，其余试剂均为分析纯。

1.2 苦瓜MAP30基因的扩增

①引物设计：根据NCBI上的序列设计扩增引物：Forward：5’-CGGGATCCATGGTGAAATGCTTACTAC-3’；Reverse：5’-CC GCTCGAGATTCACAACAGATTCC-3’，其中红色部分分别为限制性内切酶BamH I、Xho I酶切位点序列。②模板制备：刮取幼嫩苦瓜瓜皮，于液氮中研磨，按照植物基因组DNA提取试剂盒进行苦瓜基因组提取。③PCR扩增MAP30全长基因。④PCR产物回收：用1%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分离，并用Axygen公司的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的基因片段。

以上述所得基因组为模板，以pF和pR为引物，扩增MAP30全长基因，反应体系如表1。

反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸2min，共35个循环；72℃延伸10min。

1.3 将目的基因连接到载体pET-28a （+）

表1 PCR扩增MAP30基因的反应体系

将MAP30目的基因的PCR产物与pET-28a （+）载体酶切产物进行连接，16℃反应过夜。转化DH5a感受态细胞，涂氨苄抗性平板，37℃过夜培养，筛选克隆，反应体系如表2。

表2 PCR产物与pET-28a （+）的连接反应

1.4 重组质粒的酶切鉴定和序列测定

对重组质粒进行酶切鉴定，反应体系如表3。

表3 pET-28a （+）-MAP30酶切反应体系

37 ℃作用2h后1%琼脂糖凝胶电泳分析，各选择酶切鉴定正确的两个克隆送Invitrogen公司测序。

2 结 果

苦瓜MAP30基因的克隆：根据NCBI GenBank上公布的MAP30全基因序列，在MAP30基因阅读框起始与末尾设计引物，PCR扩增目的基因。目的基因片断长度约为860bp，与理论值相符。

3 讨 论

Ⅰ型核糖体失活蛋白（ribosome inhibiting protein，RIP）是一种强碱性单链蛋白质，主要富集在苦瓜种子、根、茎及叶中，具有抗肿瘤和抗病毒等生物学活性。此类蛋白的主要功能是N-RNA糖苷酶活性及切断DNA超螺旋活性，故核糖体失活蛋白可能具有类SOD活性。研究表明，MAP30对许多肿瘤细胞有较强的抑制作用。Park等[7]发现MAP30对许多类型病毒感染的细胞、肿瘤细胞非常有效，而对未感染的人正常细胞，包括T2细胞、巨噬细胞、单核细胞以及非肿瘤患者的血、肾脏、肝脏、神经、精子细胞、皮肤细胞和胚胎细胞等均无毒性。

MAP30 抗肿瘤作用的机制可能的途径包括：①抑制核糖体活性。MAP30为RIP，具有N-糖苷酶活性，能使游离核糖体28S rRNA的A4324或G4323脱去一个A，核糖体失去活性，抑制真核生物蛋白质合成，也能作用于DNA和RNA，使环状DNA变为拓扑 学 失 活 状 态[8]； ② 诱 导 细 胞 凋 亡 。 熊 术 道 等[5]研 究 表 明 ， 苦 瓜 蛋白对K562细胞生长具明显抑制作用，其机制主要通过下调Bcl-2基因表达，从而下调Bcl-2/Bax 比值来驱动细胞凋亡通路顺利进行；Fan 等[9]在实验中明显观察到MAP30导致细胞凋亡的形态学变化，Northern blots和Westernblots分析结果显示，凋亡前期蛋白Bax 的转录和表达水平均随之上调，而抗凋亡蛋白Bcl-2的转录和表达水平则有所下调。首次证明了MAP30有诱导人大肠癌LoVo 细胞凋亡的重要作用。Sun等[10]利用基因芯片分析表明，MAP30通过上调与细胞凋亡直接相关的Bxa、Caspase-3和ARADD基因的表达，从而抑制肿瘤细胞的凋亡。熊术道等[11]研究表明苦瓜蛋白可致粘附分子CD54表达上调，使细胞粘附性发生改变，从而导致肿瘤细胞凋亡；③下调肿瘤细胞增殖的相关基因。Sun等[10]利用基因芯片发现MAP30下调一些在肿瘤细胞的增殖和膨大中起作用的基因而抑制肿瘤细胞的生长。④抑制基质金属蛋白酶（MMPs）活性及表达而抑制肿瘤细胞的转移和侵袭；⑤调节白细胞介素-6（IL-6）及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等细胞因子的表达水平[11]。

本实验应用基因重组技术，以聚合酶链反应方法获得了MAP30基因全长片段 ，通过酶切、纯化、连接等重组方法，构建带有目的基因片段的克隆载体pET-28a （+）-MAP30，为进一步研究MAP30基因在真核细胞中表达蛋白，并进一步研究其生物学活性奠定基础。

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R394

：B

：1671-8194（2013）02-0057-02

中医药管理局项目资助（LZ11134）；徐州市科技计划项目（XZZD1030）

*通讯作者：E-mail：zpying58@126.com