金 杰*

（阿特维斯（佛山）制药有限公司，广东 佛山 528000）

健康志愿者氯沙坦钾片的生物等效性研究

金 杰*

（阿特维斯（佛山）制药有限公司，广东 佛山 528000）

目的 建立人血浆中氯沙坦及其代谢物氯沙坦羧酸（EXP3174）浓度的测定方法，并评价 2 种氯沙坦钾片在健康志愿者体内的生物等效性。方法 23 例男性健康志愿者随机双周期交叉给药，口服受试制剂和参比制剂 50mg，清洗期 1 周，HPLC-MS/MS 法测定血浆中氯沙坦和 HPLC-荧光法测定血浆中氯沙坦代谢物 EXP3174 浓度。所得数据经 WinNonlin 6.0 软件分析，计算氯沙坦及 EXP3174 在人体内的药代动力学参数。结果 口服受试制剂和参比制剂后，志愿者的氯沙坦和 EXP3174 主要药代动力学参数如下：氯沙坦 Cmax分别为（244.8561±86.9741）ng/mL，（266.8621± 115.5986）ng/mL；AUC0-t分别为（451.4±151.8）ng/（h ·mL），（459.4±163.7）ng/（h ·mL）；AUC0-∞分别为（469.8±155.1）ng/（h ·mL），（477.9 ±166.2）ng/（h ·mL）；t1/2分别为（1.55±0.32）h，（1.65±0.37）h；Tmax 分别为：（1.09±0.62）h，（1.25±0.75）h。EXP3174 Cmax分别为（399.4 ±100.5）ng/mL，（426.8±132.6）ng/mL；AUC0-t分 别 为（3231±1064）ng/（h ·mL），（3152±1058）ng/（h ·mL）；AUC0-∞分 别 为（3458± 1152）ng/（h ·mL），（3408±1061）ng/（h ·mL）；t1/2分别为（6.86±2.25）h，（5.77±1.47）h；Tmax分别为：（3.48±0.89）h，（3.13±0.69）h。结论氯沙坦钾受试制剂与参比制剂在人体内具有生物等效性。

氯沙坦；EXP3174；高效液相色谱 -串联质谱；高效液相色谱 -荧光检测；生物等效性

氯沙坦钾是全球第一个上市的口服非肽类血管紧张素Ⅱ受体拮抗药，可以阻断内源性及外源性的血管紧张素所产生的各种药理作用，具有良好的抗高血压疗效。氯沙坦钾口服吸收良好，经首过代谢后形成羧酸型活性代谢物EXP3174及其他无活性代谢物[1]。主要活性代谢物EXP3174的降压作用为氯沙坦的10倍[2]。因此在研究氯沙坦生物等效性和药代动力学时，同时测定氯沙坦和EXP3174是十分必要的。体内外研究表明：氯沙坦及EXP3174可以阻断任何来源或任何途径合成的血管紧张素Ⅱ所产生的相应的生理作用，与其他肽类的血管紧张素Ⅱ拮抗剂相比，氯沙坦钾无激动作用。本文用HPLC-MS/MS法测定人体内氯沙坦的血浆浓度及用HPLC-FLU法测定EXP3174的血浆浓度，对2种氯沙坦钾片进行生物等效性评价，为临床合理用药提供依据。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

氯沙坦钾片（规格：50mg/片，批号：124864），阿特维斯（佛山）制药有限公司提供；氯沙坦钾片（商品名：科素亚®，规格：50mg/片，批号：100520），杭州默沙东制药有限公司生产；氯沙坦钾对照品（批号：100597-200501，含量：100%），中国药品生物制品检定所；缬沙坦对照品（批号：100651-200902，含量：98.9%），中国药品生物制品检定所；氯沙坦羧酸（EXP3174）对照品（批号：6023，含量：95%），Ramidus AB公司；坎地沙坦对照品（批号：4-ARP-147-1，含量：98%），Toronto Research Chemicals Inc.；甲酸、乙腈、甲醇、甲基叔丁基醚和三乙胺为色谱纯；磷酸二氢钾和磷酸为分析纯；纯净水为杭州娃哈哈集团有限公司生产；空白血浆由中国人民解放军第二〇八医院提供。

1.2 仪器

API-2000串联四极杆质谱仪（配有电喷雾离子源，Analyst® 1.5.1质谱工作站，美国AB SCIEX公司）；Ultimate 3000型高效液相色谱仪（含DCMS Link 2.7.0 for Analyst液相工作站、在线脱气机、自动进样器、柱温箱，美国戴安公司）；LC-10ATvp型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；Agilent 1200 G1321A荧光检测器（含Agilent ChemStation for LC工作站，美国安捷伦公司）；XW-80A微型旋涡混合仪（上海沪西仪器厂有限公司）；KS康氏振荡器（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）；TGL-16M/TGL-20M高速台式冷冻离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；TGL-16G台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；AUW120D分析天平（日本岛津公司）；JA2003N电子天平、PHS-3E型PH计（上海精密科学仪器有限公司）；MTN-2800W型氮吹浓缩仪（天津奥特塞恩斯仪器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 试验设计

所有志愿者在试验前签署知情同意书，临床试验方案经辽宁中医药大学附属第二医院伦理委员会批准，试验在辽宁中医药大学附属第二医院药物临床试验机构进行。试验前对志愿者进行一般的体格检查，包括生命体征、血尿常规、血生化（肝肾功能、K+、Na+等）及12导联心电图检查等。体检合格的24例健康男性志愿者入组参加试验，其中1例由于个人原因于第一周期服药前退出试验，故最终23例志愿者完成了本试验。

本试验采用开放随机的双周期双交叉试验设计。每个周期志愿者禁食过夜至少10h后，次日晨空腹以250mL温开水送服50mg受试制剂或参比制剂，服药后要检查志愿者口腔和盛药容器，以确保药物的正确服用，同时进行必要的安全性评价。经过一周的清洗期后交叉服药。于每周期服药前及服药后0.25、0.50、0.75、1.00、1.50、2.00、3.00、3.50、4.00、4.50、5.00、6.00、8.00、12.00、24.00、36.00、48.00h采集静脉血5mL。采集后的血样以肝素抗凝，离心分离血浆后于-70℃冰箱中保存备用。

每周期服药后2h方可按需饮水，服药后4h、10h统一进标准餐，志愿者至少从服药前10d到最后一次采血前，禁服葡萄柚及其任何加工品；至少从服药前7d到最后一次采血前，禁服任何维生素补充剂和天然产品（包括草药，大蒜补充剂和圣约翰草）；在试验期间至少从服药前24h到最后一次采血前，禁服任何含黄嘌呤的食品和饮料，并禁止吸烟；至少从服药前48h到最后一次采血前，禁服任何含酒精的食品和饮料。

1.3.2 血浆样品中氯沙坦浓度的测定

1.3.2.1 色谱-质谱条件

分析柱：Platisil ODS（150mm×4.6mm，5μm）；预柱：琛航C18保护柱；流动相：0.2%甲酸-乙腈（30∶70）；流速：梯度流速；柱温：30℃；自动进样器温度：10℃；进样量：5μL。

质谱条件：离子源为电喷雾离子源（ESI源）；气帘气：10 Psi；碰撞气：4 Psi；Gas1：70 Psi；Gas2：50 Psi；雾化温度：450 ℃；喷雾电压：4500 V；正离子方式检测；扫描方式为多反应离子监测（MRM），用于定量分析的离子分别为氯沙坦（m/z）422.9→206.9和缬沙坦（m/z）436.1→291.2。

1.3.2.2 血浆样品处理

精密量取血浆样品200μL，置10mL离心管中，加入甲醇-水（1∶1）溶液20μL，加入内标溶液（20.2400μg/mL缬沙坦）20μL，加入5%甲酸溶液100μL，混合均匀后，加入甲基叔丁基醚3mL，涡旋混合60s，振荡混合10min，离心6min（10000 rpm），转移有机层至5mL离心管中，于40℃水浴中空气流吹干，加入流动相400μL复溶，涡旋混合60s，将溶液转移至1.5 mL离心管中，离心3min（15000rpm），取上清液5μL进样分析。

1.3.2.3 方法学验证结果

采用HPLC-MS/MS法测定血浆中氯沙坦的浓度，结果表明，氯沙坦与内标缬沙坦及血浆杂质分离良好，在4.9950～599.4000ng/mL范围内线性关系良好，定量下限为4.9950ng/mL。氯沙坦提取回收率为74.9%～77.0%，批内和批间精密度与准确度均符合相关规定，基质效应不影响分析方法的准确度和精密度。

1.3.3 血浆样品中氯沙坦羧酸（EXP3174）浓度的测定

1.3.3.1 色谱条件

分析柱：Hypersil BDS C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；预柱：琛航C18保护柱；流动相：0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲溶液（pH =3.00±0.02）-乙腈-甲醇（50∶30∶20）；荧光波长：激发波长（Excitation）：250nm，发射波长（Emission）：375nm；流速：1.2mL/min；柱温：30℃；进样量：50μL。

1.3.3.2 血浆样品处理

精密量取血浆样品500μL，置10mL离心管中，加入甲醇-水（1∶1）溶液50μL，加入内标溶液（1.0170μg/mL坎地沙坦）50μL，加入10%磷酸溶液100μL，混合均匀后，加入甲基叔丁基醚3mL，涡旋混合60s，振荡混合10min，离心6min（10000 rpm），转移有机层至5mL离心管中，于40℃水浴中空气流吹干，加入复溶溶剂乙腈-水（45∶55）150μL复溶，涡旋混合60s，将溶液转移至1.5mL离心管中，离心3min（15000 rpm），取上清液50μL进样分析。

1.3.3.3 方法学验证结果

采用HPLC-荧光法测定血浆中EXP3174的浓度，结果表明，EXP3174与内标坎地沙坦及血浆杂质分离良好，在4.8～958.0 ng/mL范围内线性关系良好，定量下限为4.8ng/mL。EXP3174提取回收率为67.2%～71.3%，批内和批间精密度与准确度均符合相关规定。

1.4 统计方法

采用WinNonlin 6.0数据统计软件计算完成试验的23例志愿者血浆中的氯沙坦及EXP3174的主要药动学参数，并对AUC0-t、AUC0-∞和Cmax经对数转换后进行方差分析，双单侧t检验。Tmax采用非参数检验[3]。

1.5 安全性评价

临床试验医师进行必要的安全性评价，采血期间定期监测生命体征，保证每天至少2次询问志愿者是否有任何不良事件，询问时避免使用诱导性语言，监护医师应保证志愿者的安全。

2 结 果

2.1 数据计算和分析结果

23例志愿者口服受试制剂（T）和参比制剂（R）后氯沙坦、EXP3174的平均血药浓度（Concentration）-时间（Time）曲线均数对比图见图1和图2。

药动参数使用WinNonlin 6.0数据统计软件进行计算。Tmax和Cmax均为实测值，血药浓度-时间曲线下面积（AUC）按梯形面积法计算。计算得到的相应药动学参数见表1。

对主要药动学参数对数转换后进行方差分析，并进一步采用双单侧t检验和[1-2α]置信区间法进行生物等效性评价，其中Tmax采用非参数检验法。结果表明，Cmax、AUC0-t、AUC0-∞均拒绝生物不等效假设，结果见表2。Tmax在受试制剂与参比制剂间无显著性差异（P ＞0.05），结果见表3。根据以上结果，受试制剂参数AUC的90%置信区间落在了参比制剂相应参数的80 %～125 %范围内，受试制剂参数Cmax的90 %置信区间落在了参比制剂相应参数的75 %～133 %范围内，因此受试制剂和参比制剂具有生物等效性[4]。

图1 氯沙坦平均血药浓度-时间曲线均数对比图（n=23）

图2 EXP3174平均血药浓度-时间曲线均数对比图（n=23）

表1 氯沙坦、EXP3174主要药动学参数[3]

表2 氯沙坦、EXP3174置信区间和个体内变异结果（n=23）

表3 氯沙坦、EXP3174 Tmax的非参数检验结果（n=23）

2.2 安全性评价结果

两个周期服药后共有8例志愿者报告了不良事件，所有不良事件均为血压下降，级别为轻度，并均在未经任何医学处理的情况下于该周期采血结束前恢复正常。试验结束后再次对志愿者进行一般的体格检查，项目与入组体检项目相同，检查结果均正常。

3 讨 论

有报道，氯沙坦钾可引起高钾血症[5]和低钠血症[6]，为了保证志愿者的安全，在入、出组血生化检查中增加了血钾和血钠，从而避免入选血钾或血钠紊乱的志愿者。氯沙坦钾作为降血压的药物，在本试验期间仅发生8例血压下降的不良事件，由此可见，氯沙坦的安全性很好，与众多一线降血压药物相比有着明显的优势。

从表2的数据可见，氯沙坦及EXP3174的个体内变异系数均＜30%，故氯沙坦及EXP3174不属于高变异药物，因此23例志愿者可以满足等效试验的统计学要求。氯沙坦钾在肝内经细胞色素P450酶（CYP3A4、2C9）转化产生活性代谢产物氯沙坦羧酸[7]，本试验受试制剂与参比制剂氯沙坦及EXP3174的药动学参数分别与文献[8-10]报道基本一致，而与非亚洲人种试验的文献[11,12]数据结果比较，代谢物EXP3174 Cmax和AUC结果相差较大，猜测这种差异可能源于不同人种体内P450酶的差别。

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Studies on Bioequivalence of Losartan Potassium Tablet in Healthy Volunteers

JIN Jie*
(Actavis (Foshan) Pharmaceuticals Co Ltd, Foshan 528000, China)

ObjectiveTo establish a method for determination of losartan and its metabolite EXP3174 in human plasma.To evaluate the bioequivalence of 2 kinds of losartan potassium tablets in healthy volunteers.MethodsA single oral dose of 50 mg test or reference preparation was adminidtrated to 23 healthy male volunteers in a randomized cross-over study with 1 week washout interval.The plasma concentrations of losartan and EXP3174 were determined by HPLC-MS/MS and HPLC-FLU.The pharmacokinetic parameters were calculated and statistically analyzed by WinNonlin 6.0 software.ResultsThe pharmacokinetic parameters of losartan and EXP-3174 of test and reference preparation were as fllows: For losartan, Cmaxwere (244.8561±86.9741) ng/mL, (266.8621 ±115.5986) ng/mL; AUC0-twere (451.4±151.8) ng/(h·mL), (459.4±163.7) ng/(h·mL); AUC0-∞were (469.8±155.1) ng/(h·mL), (477.9±166.2)ng/(h·mL); t1/2were (1.55 ±0.32) h, (1.65±0.37) h; Tmaxwere (1.09±0.62) h, (1.25±0.75) h.For EXP3174, Cmaxwere (399.4±100.5) ng/mL, (426.8±132.6) ng/mL; AUC0-twere (3231± 1064) ng/(h·mL), (3152±1058) ng/(h·mL); AUC0-∞were (3458±1152) ng/(h·mL), (3408±1061) ng/(h·mL); t1/2were (6.86±2.25)h, (5.77±1.47) h; Tmaxwere (3.48±0.89) h, (3.13±0.69) h.ConclusionTest and reference drugs of losartan potassium are bioequivalent.

Losartan; EXP3174; HPLC-MS/MS; HPLC-FLU; Bioequivalence

R917

：B

：1671-8194（2013）02-0003-03

*通讯作者：E-mail：jjin@actavis.cn