许平娟，王 秦，闫 欣

(1上海市奉贤区中心医院，上海201414;2山西医科大学第一医院)

美国风湿病学会近年的一项流行病学调查表明，类风湿关节炎(RA)已成为常见的全身性自身免疫性疾病，慢作用药物的应用使患者的致残率近年有所下降，但临床缓解率仅能达到40% ～57%，且毒副作用较为严重［1］。脐带间充质干细胞(MSCs)体内移植治疗自身免疫性疾病成为近年研究的热点，动物模型显示其能明显改善肾小球肾炎及系统性红斑狼疮等疾病的症状、有效治疗和预防移植物抗宿主病(GVHD)［2～5］，其机制可能是通过某种方式导致了T细胞的不反应［6，7］。本研究观察了脐带MSCs体外培养对Th17细胞调节机制的影响，以期为RA的免疫治疗提供依据。

1 材料与方法

1．1 材料 无菌条件下留取的足月顺产新生儿脐带(由山西医科大学第一医院妇产科提供，均征得新生儿父母同意)，用PBS反复冲洗，并仔细剔除脐带内血管，只留下华顿胶样组织。低糖DMEM培养液，Percoll分离液，Phannacia公司胎牛血清，杭州四季青公司Human Th17细胞因子，CBA分析试剂盒(Becton Dickinson公司，USA)，PCR 试剂(Fermentas公司，USA)，上海生工生物工程技术服务有限公司合成PCR引物。我院18例RA患者(RA组)及6例体检中心健康志愿者(对照组)清晨空腹静止状态抽取的静脉血15 mL，留存于肝素抗凝管，所有标本于采集后1 h内进行相关实验。其中RA组男、女各9例，年龄 23～67(38．13±12．15)岁，均符合1987年ACR修订的RA诊断标准，并除外其他慢性疾患，其中疾病活动指数(DAS)28＞5．1者6例、3．2＜DAS≤5．1者6例、DAS28≤3．2者6例;对照组男2例、女 4例，年龄24～56(46．13±11．25)岁。两组一般资料具有可比性。

1．2 脐带MSCs的分离培养及外周血单个核细胞(PBMC)的分离 ①脐带MSCs的分离培养:通过贴壁培养法分离、提纯MSCs(表型 CD45阴性，CD105、CD44、CD29阳性，CD71弱阳性)，取第 3 代生长达80%融合的贴壁MSCs细胞，用0．25%胰蛋白酶消化，胎牛血清终止反应，吸管吹打，1 500 rpm/min离心5 min后去上清，加入无血清培养液稀释进行计数，并调整细胞浓度为2×107/mL，离心后弃去无血清培养液，用稀释液按倍数稀释细胞备用。②PBMC的分离:将Hank's液与肝素钠抗凝静脉血等体积混匀，缓慢平铺在比重为1．077的淋巴细胞分离液的表面，体积比为2∶1，形成清晰的界面;室温下离心后管内溶液分为三层，上层是血浆和Hank's液、中层为淋巴细胞分离液、下层主要为红细胞和粒细胞等细胞，在上、中两层界面处见一层以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，包括淋巴细胞和少量的单核细胞;用吸管轻轻将处于分层液面白膜状的单个核细胞吸入另一离心管中，加入等量PBS液洗涤2次。将洗涤过的PBMC用L-DMEM重新悬浮，调节浓度备用。

1．3 体外MSCs与PBMC的混合培养 两组均按MSC:PBMC 分别为 1∶1、1∶10、1∶50 的比例及单纯PBMC的方式培养72 h。

1．4 PBMC 中 Th17 相关转录因子(ROR-γt)mRNA的检测 依据细胞特性(PBMC悬浮，MSCs贴壁)离心收集悬浮的PBMC，加入Trizol提取细胞沉淀，产物－70℃保存，其中一部分按说明书操作合成cRNA;PCR反应体系为20μL，上下游引物各250 nM(共1μL)及稀释的cDNA 2μL，每个样本设三个复孔，扩增条件为:85℃ 30 s，40个循环(85℃ 5 s，56℃ 31 s)。引物由上海生工生物技术工程公司合成，所用引物序列:ROR-γt上游引物 5'-CAGTGAGAGCCCAGAAGGAC-3'，下 游 引 物 5'-TCATCCCATCCATTTTTGGT-3'，扩增长度:139 bp;β-actin 上游引物5'-GGCACCCAGCACAATGAA-3'，下游引物5'-GGAAGGTGGACAGCGAGG-3'扩增长度:98 bp。

1．5 PBMC中ROR-γt蛋白的检测 采用West-bloting法。取于上述实验提取的细胞沉淀，加入1 mL蛋白裂解液，注射器反复吹打约100次，4℃下10 000 g离心5 min，取上清，加入等体积2×SDS buffer，煮沸5 min，迅速冰浴。4℃离心10 min，留取上清用于后续检测。SDS-PAGE电泳:浓缩胶恒压80 V，时间约45 min;分离胶恒压120 V，时间约3 h。PVDF膜活化:甲醇浸泡2 min，蒸馏水1 min，转入转移缓冲液中。湿转条件:恒流200 mA，2 h。5%BSA溶液4℃封闭过夜。一抗孵育:抗体稀释度:鼠源(人标本)1∶1 000和鼠源 beta-actin(1∶1 000稀释)，稀释液:TBST;4℃过夜。二抗孵育:HRP标记抗鼠二抗1∶10 000稀释(稀释液为TBST，时间室温2 h)。ECL底物化学发光显色，扫描。Photoshop软件测光密度值，收集数据。

1．6 混合培养液中细胞因子IL-17表达的检测取12×75 mm FALCON上样管，加入捕获微球混悬液及Human Th17-PE信号抗体各50 mL，每管分别加入50 mL的检测样本，室温下避光孵育3 h;每管加入1 mL洗液，1 500 rpm离心5 min，洗涤1次;每管加入300 mL洗液，重新悬浮微球。使用流式细胞仪分析样本，当日上机，上机前充分混匀3～5 s;FACSComp程序进行仪器设置调整，CellQuest软件获取样本数据，BDCBA软件分析计算结果。

1．7 统计学方法 应用SPSS13．0统计软件。计量数据以¯x±s表示，常规进行正态性及方差齐性检验，多组间均数的比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，取LSD法进行两两比较;方差不齐时，采用DunnettT3进行两两比较。P≤0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 PBMC中ROR-γt mRNA的表达 与单独PBMC培养者相比，RA组DAS28不同者PBMC混合培养后 ROR-γt mRNA的表达均有下降，(P均 ＜0．05)，其中 3．2 ＜ DAS28≤5．1 和 DAS28≤3．2 者混合培养比例不同时比较无显著差异(P＞0．05)，DAS28＞5．1者混合培养比例不同时比较有显著差异(P 均 ＜0．05，F=1．847);对照组 PBMC 混合培养后ROR-γt mRNA的表达无显著变化，P＞0．05(F=1．516)。详见表1。

表1 两组PBMC中ROR-γt mRNA的表达比较±s)

表1 两组PBMC中ROR-γt mRNA的表达比较±s)

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2．2 PBMC中 ROR-γt蛋白的表达 RA组 PBMC中ROR-γt蛋白的表达显著高于对照组(P＜0．05)。在PBMC与MSCs以1∶1浓度培养后，DAS28 ＞5．1者ROR-γt蛋白的表达明显下降，与单纯培养者比较有显著差异(P ＜0．05);3．2＜DAS28≤5．1和DAS28≤3．2 者 ROR-γt蛋白的表达下降，但与单纯培养者比较无显著差异(P＞0．05)。见表2。

2．3 培养液中IL-17水平 与PBMC单独培养者相比，RA组DAS28 ＞5．1和3．2＜DAS≤5．1者混合培养后IL-17水平显著下降，且存在MSCs浓度依赖性(P ＜0．05，F=28．441、11．743);RA 组 DAS28≤3．2者和对照组 IL-17水平无显著变化(P＞0．05)。详见表 3。

表2 两组1∶1及PBMC单独培养后PBMC中ROR-γt蛋白的表达(±s)

表2 两组1∶1及PBMC单独培养后PBMC中ROR-γt蛋白的表达(±s)

组别 n ROR-γt 蛋白的表达PBMC∶MSCs=1∶1 PBMC 单独培养RA组18 DAS28≤3．2 6 0．53 ±0．02 0．56 ±0．21 3．2 ＜ DAS28≤5．1 6 0．90 ±0．42 0．85 ±0．04 DAS28 ＞5．1 6 0．88 ±0．02 1．10 ±0．06对照组6 0．52 ±0．04 0．53 ±0．02

3 讨论

表3 两组培养液中IL-17水平比较(ng/mL±s)

表3 两组培养液中IL-17水平比较(ng/mL±s)

注:与 PBMC∶MSCs=1∶50 比较，*P ＜0．05;与 PBMC∶MSCs=1∶10 比较，△P ＜0．05;与单独培养者比较，#P ＜0．05

组别 n IL-17单独培养RA组水平PBMC∶MSCs=1∶50 PBMC∶MSCs=1∶10 PBMC∶MSCs=1∶1 PBMC 18 DAS28≤3．2 6 3．54 ±1．09 5．85 ±1．41 3．50 ±3．31 1．25 ± 0．34 3．2 ＜ DAS28≤5．1 6 7．88 ±6．68# 11．88 ±5．82*# 16．43 ±7．46*# 5．60 ± 2．80 DAS28 ＞5．1 6 10．67 ±9．08# 18．42 ±9．06*# 26．76 ±9．59＊△# 14．40 ± 2．70对照组6 3．63 ±2．52 3．34 ±0．25 6．95 ±2．05 51．35 ±13．13

既往研究发现，RA患者炎性关节局部有大量Th1细胞聚集，故一度被认为是以Th1细胞占主导地位的疾病。但近年研究发现，RA滑膜层存在能产生细胞因子IL-17的T淋巴细胞、滑液中高表达IL-17，胶原诱导关节炎(CIA)动物模型也证实IL-17通过促进炎性细胞因子IL-6、TNF-α的合成参与RA的炎症反应过程，推测Th17细胞在RA发病中具有比 Th1 更为重要的作用［8，9］。Ivanov 等［10］研究认为，孤束核受体(RORγ)是Th17细胞分化的关键转录因子，小鼠缺乏RORγ时自身免疫性疾病发生率下降，Th17细胞数量也相应减少。Nurieva等［11］的实验证明，IL-6能通过STAT3诱导Th17细胞分泌IL-21，而自分泌的 IL-21可通过 STAT3上调RORγ，诱导T细胞进一步向Th17细胞分化。同时IL-17在RA患者滑膜层可以通过刺激滑膜细胞表达分泌角质细胞生长因子(KGF)等血管因子促进血管翳的形成，在RA的早期即发挥破坏作用［12，13］。有关人、鼠关节移植的研究提示，IL-17自身能够刺激炎症反应的发生，并使Th17细胞迅速产生，在炎症急性期发挥一定作用［14］;还能通过诱导滑膜细胞和软骨细胞表达金属蛋白酶，使蛋白多糖分子断裂，破坏软骨组织;除促进炎性介质如TNF-α、IL-1等分泌外，还可诱导NF-κB受体活化因子配基(RANKL)的表达，而RANKL是破骨细胞活化和骨质吸收的必要条件［15，16］。因此，在骨质破坏反应中 IL-17对破骨细胞的活化和骨质的吸收方面发挥重要作用。

Kirkham等［17］进行的2 a的前瞻性研究发现，滑膜IL-17水平可作为RA关节损伤进展的检测指标，同时与TNF-α有协同作用，尤适用于RA发病短期内的检测指标，关节腔滑膜中IL-17 mRNA的表达水平可预示损伤程度。在此基础上，本研究观察了体外脐带MSCs培养对RA患者PBMC中Th17相关转录因子及细胞因子表达影响，旨在进一步寻找MSCs调控Th17细胞的可能机制。结果显示，MSCs体外对RA患者PBMC中RORγt mRNA和蛋白水平均有一定抑制作用，尤其是在病情高度活动者，此种抑制效应呈剂量依赖性，但在缓解期患者未能看到此抑制效应。提示MSCs在体内免疫调节机制的发挥与内环境的炎性刺激有关，此为MSCs在临床应用中适应证的选择提供了依据;也提示这种抑制作用的发挥可能与基质细胞的细胞接触机制和分泌机制有关。本研究还显示，RA组病情缓解者和对照组IL-17水平并未受到MSCs的抑制，但RA疾病活动者IL-17呈高表达，且高度活动者的抑制效应呈剂量依赖性。提示MSCs作为一种储备细胞，正常生理状态下其机能可能是静止的，那么如何找到激活其调节功能的节点，寻找发挥其效能的有力干预措施尚需进一步深入研究。

最近，已经有学者报道MSCs与IFN-γ等因子作用后免疫调节能力增强，更有学者已经尝试了采用IFN-γ刺激MSCs之后再用于治疗GVHD，并取得了较好疗效［18］。

综上所述，脐带MSCs体外培养能影响RA患者的Th17细胞调节机制，此为临床RA的免疫调节治疗提供了依据。

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