闫 睿，初桂兰

(天津医科大学总医院，天津300052)

新生儿缺氧缺血性脑损伤(HIBD)是指围产期胎儿宫内窘迫或出生后缺氧状态延续导致的新生儿损伤，现认为其带来的危害已不仅仅局限于神经系统，泌尿系统受累亦十分常见［1］。窒息缺氧时由于全身血液重新分布，导致肾脏血流进一步减少，同时合并酸中毒则可使细胞受损出现肾损害，严重时甚至可能发生肾衰竭。国内外都有临床试验证实，HIBD患儿的血尿素氮和肌酐均较正常新生儿有所上升，而且尿酸和肌酐的比值也同时上升。甚至有报道指出，窒息新生儿肾损害发生率高达42%［2］。现研究认为，细胞凋亡是器官功能障碍的物质基础之一。2011年3～9月进行了此项研究，通过测定肾脏四种凋亡基因 bax、bcl-2、fas、fasL mRNA 的含量，探讨HIBD对肾组织中细胞凋亡基因表达的影响及其与缺氧时间的关系。

1 材料与方法

1．1 实验动物 新生7 d Wistar大鼠，生长条件相同，体质量(15．2 ±3．1)g，雌雄不限，共 96 只，由天津市放射研究所实验动物中心提供。

1．2 方法

1．2．1 实验分组 参照Rice等和国内吴婉芳等的方法，建立新生大鼠HIBD模型。对照组只予分离但不结扎左侧颈总动脉，处理组结扎左侧颈总动脉，术后放回母鼠身边恢复2 h。后置于2 500 mL密闭玻璃容器中，以1～2 L/min的速度输入湿化的8%氧气和92%氮气的混合气体(即缺氧处理)一段时间后处死;根据缺氧处理的时间将大鼠分为1、6、12、24、48、72 h 组(每组 8 只)，同时在相应时间点设立对照组(即假手术组)。HIBD模型制备成功的指标包括体质量增长缓慢、左右脑重比值下降、行为能力障碍、病变侧脑组织大体及显微镜下异常改变等。

1．2．2 测定指标及方法 无菌条件下分离右侧肾，迅速－180℃液氮冷冻处理，利用Trizol一步法(Invitrogen)提取 RNA，采用 RT-qPCR法测定组织中bcl-2、bax、fas、fasL 基因的表达量。

1．2．3 统计学方法 采用SPSS11．5统计学软件。各组数据均以¯x±s表示，各相同时间点的对照组和处理组之间采用独立样本的t检验，不同时间点的对照组和处理组间先进行随机分组设计资料的方差分析，如存在组间差异则进一步进行两两比较的q检验。P≤0．05为有统计学差异。

2 结果

2．1 bcl-2基因 处理组均低于相应对照组，且差异具有统计学意义。缺血缺氧1 h为表达高峰(包括对照组和处理组)，其次为12 h，其余组别表达量不足上述两组的1%，接近于零，其中24 h表达量最低。除1 h和12 h组外，其余时间点与对照组之间和处理组之间差异无统计学意义。见表1。

表1 肾组织中bcl-2基因在不同时间点的表达强度±s)

表1 肾组织中bcl-2基因在不同时间点的表达强度±s)

组别 n 1 h 6 h 12 h 24 h 48 h 72 h F P对照组 8 1．065 2 ±0．065 9 0．015 5 ±0．002 3 0．883 4 ±0．145 4 0．008 1 ±0．000 7 0．027 0 ±0．006 2 0．042 2 ±0．004 6 287．154 0．000处理组 8 0．816 9 ±0．017 6 0．006 4 ±0．000 1 0．592 7 ±0．037 9 0．005 9 ±0．000 1 0．008 4 ±0．000 2 0．016 6 ±0．000 2 2 299．491 0．000 t 8．137 8．724 4．325 6．937 6．681 12．308 P 0．000 0．000 0．003 0．000 0．000 0．000

2．2 bax基因 处理组均高于相应对照组，1 h表达量均为最高，其中处理组表达量约为对照组的3倍，6 h最低，而后表达量随时间延长而逐渐递增，处理组的表达量均可达到对照组的2倍以上。对照组1 h和72 h表达量接近，差异无统计学意义，而同其他时间点组别相比则有统计学差异。处理组各时间点表达量差异有统计学意义。见表2。

表2 肾组织中bax基因在不同时间点的表达强度±s)

表2 肾组织中bax基因在不同时间点的表达强度±s)

组别 n 1 h 6 h 12 h 24 h 48 h 72 h F P对照组 8 0．843 6 ±0．321 6 0．166 9 ±0．008 1 0．386 3 ±0．120 3 0．345 6 ±0．203 4 0．501 0 ±0．149 4 0．799 4 ±0．127 5 10．765 0．000处理组 8 2．430 2 ±0．056 0 0．261 4 ±0．013 6 0．806 5 ±0．008 2 0．927 2 ±0．015 1 1．125 0 ±0．025 1 1．384 4 ±0．018 8 3 458．789 0．002 t－10．868 －13．392 －7．793 －6．374 －9．21 －10．15 P 0．000 0．000 0．000 0．000 0．000 0．000

2．3 bcl-2/bax 相同时间点处理组比值低于对照组，12 h比值最高，其次为1 h。在这两个时间点，对照组该比值大于1，处理组为0．1～1，与其他时间点比较差异有统计学意义。其余时间点对照组比值集中在 0．03 ～0．09，处理组集中在 0．006 ～0．03，不同时间点差异无统计学意义。见表3。

表3 肾组织中不同时间点的bcl-2/bax比值(¯±s)

表3 肾组织中不同时间点的bcl-2/bax比值(¯±s)

组别 n 1 h 6 h 12 h 24 h 48 h 72 h F P对照组 8 1．462 5 ±0．665 5 0．092 9 ±0．016 1 2．535 0 ±1．164 9 0．032 5 ±0．021 9 0．062 6 ±0．040 7 0．053 3 ±0．006 3 18．6 0．000处理组 8 0．336 4 ±0．014 8 0．024 5 ±0．001 7 0．735 1 ±0．051 0 0．006 4 ±0．000 2 0．007 4 ±0．000 1 0．012 0 ±0．000 2 944．866 0．000 t 3．783 9．464 3．452 2．667 3．029 14．559 P 0．005 0．000 0．009 0．028 0．016 0．000

2．4 fas基因 1、6、12 h 3个时间点处理组表达量高于对照组，而在24、48、72 h 3个时间点处理组表达量低于对照组，其中对照组的表达高峰出现在1 h，处理组的表达高峰出现在12 h，前期无论是对照组还是处理组(尤其以处理组更为明显)表达量远远高于实验后期，且差异有统计学意义。见表4。

表4 肾组织中fas基因在不同时间点的表达强度(±s)

表4 肾组织中fas基因在不同时间点的表达强度(±s)

组别 n 1 h 6 h 12 h 24 h 48 h 72 h F P对照组 8 1．307 8 ±0．302 9 0．060 1 ±0．017 5 1．078 6 ±0．327 2 0．292 5 ±0．099 9 0．545 5 ±0．244 0 0．009 8 ±0．002 1 32．426 0．000处理组 8 2．190 1 ±0．060 4 0．169 0 ±0．001 8 2．882 7 ±0．003 3 0．029 6 ±0．000 7 0．128 5 ±0．001 6 0．042 7 ±0．000 9 13 437．5 0．002 t－6．388 －13．818 －12．329 5．883 3．821 －31．856 P 0．000 0．000 0．000 0．000 0．005 0．000

2．5 fasL基因 1、6 h处理组表达量高于对照组，1 h为处理组表达高峰，是同一时间点对照组表达量的10倍，其次为6 h，处理组表达较1 h明显下降，约相当于对照组的3倍，且为对照组表达最低点。其余时间点处理组表达量低于对照组。12 h为对照组表达高峰，余时间点表达量迅速下降，只相当于12 h表达量的十分之一不到，差异有统计学意义，处理组表达量接近于零。见表5。

表5 肾组织中fasL基因在不同时间点的表达强度±s)

表5 肾组织中fasL基因在不同时间点的表达强度±s)

组别 n 1 h 6 h 12 h 24 h 48 h 72 h F P对照组 8 0．970 1 ±0．219 8 0．044 5 ±0．011 3 9．667 0 ±4．448 9 0．128 0 ±0．034 9 0．498 6 ±0．221 0 0．138 1 ±0．072 0 21．966 0．000处理组 8 10．094 0 ±0．076 38 0．117 0 ±0．003 3 2．783 7 ±0．020 4 0．029 1 ±0．000 7 0．035 8 ±0．000 4 0．062 8 ±0．001 6 77 512．3 0．002 t－87．685 －13．799 3．46 6．334 4．683 2．34 P 0．000 0．000 0．009 0．000 0．002 0．047

2．6 fas/fasL 6、12 h 处理组比值高于对照组，1、24、48、72 h低于对照组，其中6 h为最高值，其次为12 h，除12 h和24 h之间差异无统计学意义外，其余组别差异均有统计学意义，整体呈现先升高再降低的趋势，在6 h达到比值最大，72 h比值最低，整体变化均匀，比值 0．2～1．5。72 h为对照组最高值，其次为24 h。除72 h外，其余组别之间差异无统计学意义，比值集中在1～3，变化差异较小，整体要高于处理组。见表6。

表6 肾组织中不同时间点的fas/fasL比值(±s)

表6 肾组织中不同时间点的fas/fasL比值(±s)

组别 n 1 h 6 h 12 h 24 h 48 h 72 h F P对照组 8 1．393 5 ±0．411 3 1．363 8 ±0．329 0 0．129 7 ±0．067 0 2．260 8 ±0．530 4 1．523 4 ±0．422 5 9．066 7 ±4．708 5 13．663 0．000处理组 8 0．217 0 ±0．005 0 1．445 9 ±0．005 4 1．035 6 ±0．008 6 1．018 5 ±0．033 5 0．454 8 ±0．006 8 0．086 0 ±0．002 5 2 069．122 0．000 t 6．396 －0．551 －29．986 5．226 5．655 4．265 P 0．000 0．597 0．000 0．001 0．000 0．003

3 讨论

研究发现，新生7 d大鼠的中枢神经系统是不成熟的，其发育程度类似于孕32～34周的人类胎儿或新生儿，HIBD通常局限于颈总动脉结扎那一侧的大脑半球，包括选择性神经元死亡和凋亡，大脑皮层、皮质下及脑室周围白质、海马、纹状体及丘脑组织损伤［3］，但上述部位损伤后造成的其他器官功能改变研究尚不多见。本实验采用该模型，旨在研究HIBD对于肾的影响，结果表明该种损伤虽未直接作用于肾，但同样可以促进肾细胞的凋亡，进而影响机体代谢功能，影响预后。

新生儿窒息导致肾损伤机制:新生儿期肾血流量少，1周内小儿肾血流量只占心排出量的8% ～12%(成人为25%)。由于新生儿肾单位发育未完善，肾小管发育比肾单位更差;窒息时全身血液重新分布，为保证心脑的血液供应，肾脏等内脏器官血管收缩，肾脏血流量减少，因此缺氧时肾功能更易受损［4］。同时缺氧使血栓素 A2产生增多，导致肾皮质与髓质血细胞聚集，体内抗利尿激素、儿茶酚胺分泌增高，促使肾素释放，继而血管紧张素Ⅱ形成，导致肾动脉收缩，使肾血流灌注减少，肾脏发生缺血缺氧;加之缺氧时合并酸中毒，使细胞受损而出现肾损害，肾小球及肾小管受损，严重时可致肾小管坏死而发生急性肾衰。已有实验证明［5］，HIBD新生大鼠血尿素氮、肌酐较正常对照组均明显升高，说明其肾功能明显受损，与临床报告一致［6］。这一过程中最先受到损伤的细胞是肾小管上皮细胞［7］，窒息后缺氧缺血使肾小管上皮细胞肿胀，出现水样变性和空泡变性，肾小管管腔扩张，管内可见管型和坏死脱落细胞，少量肾小管腔内有蛋白性液体积聚，间质充血水肿大量炎细胞浸润，管周血管明显扩张淤血。上皮细胞核染色质边集，胞质空泡样变性。12～48 h细胞可以通过死亡配体与死亡受体、凋亡相关基因、氧化应激、线粒体细胞色素C等多种途径引起肾小管上皮细胞凋亡和功能障碍［8，9］。

细胞凋亡是由基因控制的细胞生理性、自主性的死亡过程［10］。其中bcl-2与bax互为配体，fas与fasL互为配体。当bcl-2与bax形成异二聚体时抑制凋亡，而bax强过量表达时则自身蛋白形成同源二聚体，促进凋亡发生［11］。本研究显示，对照组bcl-2始终高于处理组，说明HIBD抑制了抗凋亡基因bcl-2的表达。但两组的变化趋势是相似的，即都在1 h表达量最高，其次为12 h，其他时间点表达量小于本组上述两个时间点的1%，这又提示HIBD对该基因的影响是较小的，没有改变肾发育的一般轨迹。其表达量在不同时间点的骤然变化应当主要是受肾发育一般规律的作用，说明早期细胞增生活跃，抗凋亡作用较强，而后随着时间的推移抗凋亡作用逐渐减弱。通过同一时间点不同组别的对比发现，6 h出现的表达低谷提示早期的bcl-2大量表达抑制了DNA的继续转录，但该时间点处理组与对照组相比较1 h下降的更为明显，可能是急性缺氧期引起了血流的重新分布，使得处理组抗凋亡基因表达急剧下降。而在12 h之后机体逐渐耐受缺氧，抗凋亡基因的表达量逐渐恢复，两组的表达量差异较6 h缩小，48 h后HIBD造成的肾损害不可逆的加重，从而使处理组bcl-2下降明显增加。bax在1 h表达量最高，6 h最低，而后表达量逐渐升高，各组均有统计学差异。bax作为促凋亡基因，1 h属于急性缺氧期，与抑凋亡基因一样，该时段bax表达量相当高，考虑属于应激反应，即细胞活性增强，各种基因表达上调;随着缺氧时间的延长，该基因表达逐渐增加，凋亡越来越占主要地位。bcl-2/bax的比值在各个时间点处理组均低于对照组，由于二者的比值更能准确地预示凋亡的发生，我们可以推断HIBD的确起到了促进肾细胞凋亡的作用。该比值在12 h最高，其次为1 h，其他组别比值均显著低于上述两组。缺氧作为公认的凋亡诱导的因素之一，在HIBD急性期并没有促进细胞凋亡，相反抗凋亡起到主导作用，揭示了器官对缺氧的耐受能力;而后期12 h抑凋亡基因再次大量表达，并使抗凋亡作用达到顶峰，考虑是随着bax的大量表达激活了bcl-2基因，baxbcl-2蛋白结合紧密，不易降解，也就意味着需要大量新的bcl-2产生去结合新产生的bax，但是，随着缺氧时间的延长，抑凋亡基因受到抑制，使肾脏细胞不可避免的发生凋亡，进而导致器官功能障碍。

fas诱导的细胞凋亡是由于膜fasL、抗fas-特殊的抗体和块状可溶的fasL的刺激引起的［12］。有研究用TUNEL法测得急性肾衰竭肾小动脉、肾小管及周围区域的细胞凋亡数目增加，凋亡小体与肾功能改变呈正相关;同时免疫组化结果显示，fas/fasL在ARF肾组织的近曲小管、远曲小管周围表达增加，提示fas/fasL途径参与了肾小管上皮细胞凋亡的发生，而本研究也有相似的发现。处理组fas在12 h表达量最高，其次为1 h;与fas相似的是，处理组fasL在1 h表达量远远高于其他各组，其次为12 h，其他各组表达量极微，不足1%。考虑到fasL仅仅表达于活化的T细胞，可以说明肾脏在缺氧1 h时T细胞总数较多，通过与fas相作用诱导细胞凋亡，后受到缺氧抑制，表达量急剧下降。fas/fasL的比值是决定细胞发生凋亡与否的重要因素，早期的fas和fasL表达量及其比值在处理组均高于相应时间点的对照组，说明HIBD早期(12 h以内)fas/fasL作为促进凋亡发生的途径之一与bcl-2/bax协同作用，共同促进肾细胞的凋亡;而在后期fas和fasL及其比值在对照组反而要高于处理组，考虑到fasL只表达于活化的T细胞，通过与表达fas的靶细胞相互作用诱导靶细胞凋亡，说明在缺氧的作用下肾组织内活化的T细胞数量减少，表达fas的靶细胞由于前期的凋亡作用数量亦有所下降，因此整体表达量要低于对照组，此时只有bcl-2/bax途径起到主要的促凋亡作用。

通过本实验，我们可以进一步明确缺氧缺血性脑损伤不是单纯的神经系统疾病，其可促进肾细胞的凋亡。通过本实验所设置的时间组来看，1～12 h是细胞发生凋亡的高峰期，因此，强调早期诊断、早期治疗有着重要意义。不仅可以减少神经系统后遗症的发生，还可以降低由于细胞凋亡引起的肾功能受损程度，从而维持机体正常代谢，提高整体预后。

［1］Shah P，Riphagen S，Beyene J，et al．Multiorgan dysfunction in infants with post-asphyxial hypoxic-ischaemic encephalopathy［J］．Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed，2004，89(2):F152-155．

［2］Wilcox AL，Calise DV，Chapman SE，et al．Hypoxic/ishchemic encephalopathy associted with placental insufficiency in a cloned foal［J］．Vet Phthol，2009，45(1):75-79．

［3］Yang D，Nemkul N，Shereen A，et al．Therapeutic administration of plasminogen activator inhibitor-1 prevents hypoxic-ischemic brain injury in newborns［J］．J Neurosci，2009，29(27):8669-8674．

［4］Róka A，Melinda KT，Vásárhelyi B，et al．Elevated morphine concentrations in neonates treated with morphine and prolonged hypothermia for hypoxic ischemic encephalopathy［J］．Pediatrics，2008，121(4):e844-849．

［5］Stefanutti G，Pierro A，Parkinson EJ，et al．Moderate hypothermia as a rescue therapy against intestinal ischemia and reperfusion injury in the rat［J］．Crit Care Med，2008，36(5):1564-1572．

［6］Abend NS，Monk HM，Licht DJ，et al．Intravenous levetiracetam in critically ill children with status epilepticus or acute repetitive seizures［J］．Pediatr Crit Care Med，2009，10(4):505-510．

［7］沈延春，杨晓，朱忠华，等．5/6肾切除大鼠残肾细胞凋亡的信号途径研究［J］．中国现代医学杂志，2006，16(7):988-991．

［8］Sun HY，Wang NP，Halkos M，et al．Postconditioning attenuates cardiomyocyte apoptosis via inhibition of JNK and p38 mitogen-activated protein kinase signaling pathways［J］．Apoptosis，2006，11(9):1583-1593．

［9］Chien CT，Chang TC，Tsai CY，et al．Adenovirus-mediated bcl-2 gene transfer inhibits renal ischemia/reperfusion induced tubular oxidative stress and apoptosis［J］．Am JTransplant，2005，5(6):1194-1203．

［10］Hallett JM，Leitch AE，Riley NA，et al．Novel pharmacological strategies for driving inflammatory cell apoptosis and enhancing the resolution of inflammation［J］．Trends Pharmacol Sci，2008，29(5):250-257．

［11］Susnow N，Zeng L，Margineantu D，et al．Bcl-2 family proteins as regulators of oxidative stress［J］．Semin Cancer Biol，2009，19(1):42-49．

［12］Gordon N，Kleinerman ES．The role of fas/fasL in the metastatic potential of osteosarcoma and targeting this pathway for the treatment of osteosarcoma lung metastases［J］．Cancer Treat Res，2010(152):497-508．