覃慧婵，柳广南，苏 红，张建全，傅钰雁

(广西医科大学第一附属医院，南宁530021)

原发性支气管肺癌简称肺癌，为最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和病死率都有逐年增高的趋势。目前，肺癌的临床诊断主要依靠影像学(胸部X线片和CT)、细胞病理学(痰脱落癌细胞)和组织学(病理切片)等检查。这些传统的诊断方式虽在临床上应用多年，但往往不能早期发现肺癌，以致于80%肺癌患者在就诊时已丧失手术机会。因此，早期发现、早期诊断和早期治疗是提高肺癌生存率的关键。肺癌依据其病理类型分为两大类:小细胞肺癌及非小细胞肺癌，而非小细胞肺癌又分为鳞癌、腺癌、大细胞癌等;近年来，肺腺癌的发病率有不断上升的趋势，但其癌变机制仍不十分明确，尚缺乏有效的用于肺腺癌早期诊断和预后监测的生物标志物。同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)联合液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)技术是近年来开发的一种新的蛋白质组学定量技术，是一种理想的寻找生物标志物的技术［1］，已被应用于乳腺癌、前列腺癌、子宫内膜癌等血清标志物的研究［2～4］。本研究旨在应用iTRAQ联合LC-MS/MS技术筛选出用于诊断肺腺癌的血浆生物标志物。

1 资料与方法

1．1 临床资料 选择2011年9月～2012年9月在广西医科大学第一附属医院住院的肺腺癌患者10例(腺癌组)，男5例、女5例，年龄35～70(53．80±11．54)岁，均经病理学检查确诊，且均未行放疗或化疗;选择同期健康体检者10例(正常组)，男5例、女5 例，年龄30～70(52．36 ±10．17)岁。两组研究对象在性别、年龄上差异均无统计学意义(P均＞0．05)，两组血浆标本获得均经过患者或家属知情同意。

1．2 方法

1．2．1 血浆标本的采集与保存 所有血浆样品为清晨空腹时使用抗凝管采集，在4℃下以3 000g离心10 min，收集上清液，冰上分装后－80℃冰箱保存备用。

1．2．2 去除血浆高丰度蛋白 两组血浆样品均进行组内等体积混合，然后按照Proteominer试剂盒的操作步骤去除血浆高丰度蛋白，并采用Brandford法测定蛋白含量;取 0．5μg/μL蛋白上样，行 SDSPAGE，检测样品中高丰度蛋白的去除情况。

1．2．3 蛋白酶解及iTRAQ标记 每组精确取出100μg蛋白，蛋白∶酶按20∶1的比例加入Trypsin，37℃酶解4 h。按上述比例再补加1次Trypsin，37℃继续酶解8 h。胰蛋白酶消化后，用真空离心泵抽干肽段;用0．5 mol/L TEAB复溶肽段，按照手册进行iTRAQ;两组肽段被不同的iTRAQ标签标记(正常组以113标记，腺癌组以118标记)后，室温培养2 h。

1．2．4 SCX强阳离子交换柱分离蛋白 将标记后的两组肽段混合，采用岛津LC-20AB液相系统、分离柱为4．6 mm×250 mm型号的SCX柱对样品进行液相分离。将标记后抽干的混合肽段用4 mL buffer A(25 mmol/L NaH2PO4，25%CN，pH 2．7)复溶。进柱后以1 mL/min速率进行梯度洗脱:先用buffer A洗脱10 min，再逐渐混入5% ～35%buffer B(25 mmol/L NaH2PO4，1 mol/L KCl，25%ACN，pH 2．7)洗脱11 min，最后逐渐混入35% ～80%buffer B洗脱1 min。整个洗脱过程在214 nm吸光度下进行监测，经过筛选得到20个组分。每个组分分别用StrataX除盐柱除盐，然后冷冻抽干。

1．2．5 基于 Triple TOF 5600的 LC-ESI-MS/MS分析 与质谱仪相结合的液相系统为nanoACQuity(Waters)，包括 Symmetry C18柱(规格 5 μm，180 μm ×20 mm)和 BEH130 C18柱(规格1．7 μm，100 μm×100 mm)两部分。Symmetry C18柱用于肽段吸附和除盐，BEH130 C18柱用于分离。所用的流动相A液(水∶乙腈∶甲酸=98∶2∶0．1)和B 液(水∶乙腈∶甲酸=2∶98∶0．1)中都加入一定比例的校正液。每次上样量为2．25μg(9μL)，用A液以2 μL/min的流速洗脱15 min，进行肽段吸附和除盐。接下来用含5%B液的流动相以300 nL/min流速洗脱1 min，开始建立洗脱梯度:40 min内B液梯度线型从5%升至35%，再5 min从35%升至80%，然后80%持续洗脱5 min，最后2 min恢复柱料。使用的机器为 TripleTOF 5600(AB SCIEX，Concord，ON)，离子源为 NanosprayⅢ source(AB SCIEX，Concord，N)，放射器为石英材料拉制的喷针(New Objectives，Woburn，MA)。数据采集时，机器的参数设置如下:离子源喷雾电压2．5 kV，氮气压力为30 psi(14．5 psi≈1 bar)，喷雾气压 15 psi，喷雾接口处温度150℃;扫描模式为反射模式，分辨率≥30 000;积累250 ms的从2+到5+的离子挑选其中强度每秒积累超过120分的前30个进行扫描，3．3 s为1个循环;第2个四极杆(Q2)的传输窗口设置为100 Da为100%;脉冲射频电的频率为11 kHz;检测器的检测频率为40 GHz;每次扫描的粒子信号以4个通道分别记录共4次后合并转化成数据;对于iTRAQ类项目，离子碎裂的能量设置为(35±5)eV;母离子动态排除设置:在一半的出峰时间内(约18 s)，相同母离子的碎裂不超过2次。

1．2．6 数据库检索及生物信息学分析 用Mascot 2．3．02蛋白质鉴定软件对数据库 IPI:homo(91464sequences)，V-3．87 进行搜索，软件依据同位素报告基团的相对含量进行蛋白质定量，以报告基团113为参照，选择差异显著(P≤0．05)的结果进行报告。以比值＞1．50或＜0．67作为阈值选取差异蛋白。鉴定得到的蛋白进行基因功能聚类分析(GO)及基因路径分析。

2 结果

2．1 质谱鉴定结果 质谱共鉴定到蛋白369个，其中差异表达的蛋白有35种，腺癌组较正常组上调的蛋白有21种，下调的蛋白有14种。见表1。

表1 腺癌组与正常组比较上调比值＞1.50或下调比值＜0.67的蛋白

2．2 生物学功能分析 本研究对369个通过鉴定的蛋白进行GO分析及pathway分析。结果发现，这369个蛋白分别参与了26个生物学过程，有18种分子功能，参与52个生物代谢通路。排名前3位的生物学过程为免疫与防御(13．6%)、发育过程(11．7%)、分子转运(9．4%)，分子功能为结合功能蛋白(15．7%)、催化功能蛋白(12．5%)、转运蛋白(9．3%)，生物代谢通路为炎症信号通路(25．6%)、整合素信号通路(11．9%)、凋亡信号通路(5．7%)。

3 讨论

肺腺癌多数起源于较小的支气管，为周围型肺癌，故早期一般没有明显的临床症状，许多患者在就诊时已丧失最佳治疗时机。因此，越来越多的研究致力于寻找肺腺癌早期生物标志物以助诊断，近年来，iTRAQ联合LC-MS/MS技术已经逐渐成为差异蛋白质组学定量研究的主要工具之一，广泛应用于肿瘤标志物的发现、常见疾病差异表达蛋白质的鉴定，有利于阐明疾病的发生机理，对疾病的预防、诊断、预后和疗效监测具有重要作用，并有助于用作靶点来开发临床治疗药物。

iTRAQ联合LC-MS/MS技术在肺腺癌的研究方面已取得一定的成果。Chuncg等［5］应用iTRAQ联合LC-MS/MS技术筛选12例肺腺癌及癌旁正常组织的差异蛋白，并应用免疫组化的方法进行鉴定，发现AGR2有望成为肺腺癌潜在的肿瘤标志物。Keshamouni等［6］应用 iTRAQ 联合 LC-MS/MS 技术鉴定出了肿瘤坏死因子-β(TGF-β)诱导肺腺癌细胞株A549上皮间叶转化的相关蛋白质，发现了许多与细胞迁移、黏附和浸润作用有关的蛋白质。张薇等［7］应用iTRAQ标记技术联合LC-MS/MS方法筛选肺腺癌细胞株、小细胞肺癌细胞株和人正常支气管上皮细胞株的差异蛋白，发现HSP90和波形蛋白有望成为肺腺癌的候选肿瘤标志物。

本研究采用iTRAQ联合LC-MS/MS技术筛选肺腺癌组与正常组血浆差异蛋白，共鉴定差异表达的蛋白有35种，腺癌组较正常组上调的蛋白有21种，下调的蛋白有14种，其中，SCGB3A2、SFTPB表达显著上调。SCGB3A2又称子宫珠蛋白相关蛋白1(UGRP-1)，在免疫调节和抗炎活动中起着重要的调节作用，因此SCGB3A2的表达水平可能对疾病的诊断及预后效果的评价有一定的指导作用。目前，关于SCGB3A2在肺腺癌方面的研究甚少Kurotani等［8］通过免疫组化的方法检测到SCGB3A2在肺腺癌患者中高表达，提示SCGB3A2有望成为肺腺癌的生物标志物;而国内尚未见SCGB3A2在肺腺癌研究方面的报道。本研究中发现SCGB3A2在肺腺癌组血浆中的表达显著高于正常组，说明SCGB3A2在肺腺癌的癌变过程中起一定作用，有进一步研究的价值。

SFTPB即表面活性蛋白B，主要由肺泡Ⅱ型细胞合成和分泌，是肺表面物质形成所必需的物质，与肺的发育过程密切相关，其遗传缺陷与NRDS、急性呼吸窘迫综合征、先天性肺泡蛋白沉积症、成年慢性阻塞性肺气肿等呼吸系统疾病相关联。Sumita等［9］研究发现，SFTPB基因敲除小鼠和SFTPB基因突变新生儿出生后死于呼吸窘迫。而SFTPB表达与肺腺癌是否存在关联，国内外仅有几篇报道，Xi等［10］研究发现，SFTPB在肺腺癌及肺鳞癌组织中表达均增高。本研究发现SFTPB在肺腺癌组血浆中表达明显高于正常组，提示SFTPB在肺腺癌的发病中可能发挥作用。

总之，本研究应用iTRAQ联合LC-MS/MS技术能很好地进行了肺腺癌的差异蛋白质组学分析，能一次性筛选出35种与肺腺癌相关的差异蛋白，并能对其进行定性及相对定量;对筛选出的差异蛋白进行生物信息学分析，还能了解其参与的生物学过程及代谢通路等，为肺腺癌的发病机制提供新的线索;本研究中筛选出的表达有显著差异的蛋白SCGB3A2、SFTPB有望成为潜在的肺腺癌血浆生物标志物，值得进一步研究。

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