李娜，张莉，郭敏

(辽宁医学院组织胚胎学教研室，辽宁 锦州 121001)

神经病理性疼痛(Neuropathic Pain，NPP)是由于感染、外伤、肿瘤等原因导致的神经系统损伤后的一种慢性疾病状态，其主要的临床病理生理学特点是痛觉过敏、痛觉超敏、感觉缺失及自发疼痛等［1－3］。近年来，NPP 的发病率逐年增高，由于缺乏有效的治疗手段，因此已经严重影响了患者的生存质量。研究发现，脊髓后角神经细胞凋亡是NPP发病的重要机制之一［4］，而微量元素锌可能参与了NPP 的形成与传导［5］，因此，为了深入研究锌参与NPP 的可能机制，本研究拟应用免疫组织化学技术、免疫印迹技术和图像分析技术检测锌预处理对辣椒素致痛模型小鼠脊髓后角caspase－9 的表达的影响，从而为深入研究锌参与NPP 的发病机制提供基础的实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物分组与模型制备

8 周龄C57/BL6 小鼠48 只，雌雄各半，体重30～40 g，随机分为4 组:(1)对照组(Con):正常喂养(锌:30.0 mg/kg)2 w 后足底注射生理盐水;(2)N－CAP 组:正常喂养(锌:30.0 mg/kg)2 w后足底注射辣椒素(0.5%，5 μL); (3)L－CAP组:低锌喂养(锌:0.85 mg/kg)2 w 后足底注射辣椒素(0.5%，5 μL); (4)H－CAP 组:高锌喂养(饮用硫酸锌水溶液，227 mg/L)2 w 后足底注射辣椒素(0.5%，5 μL)。

1.2 取材与标本制备

足底注射辣椒素后7 d，取小鼠腰5 节段脊髓，一部分用于免疫印迹检测，一部分经4%多聚甲醛固定12 h 后制备5 μm 厚的石蜡切片备用。

1.3 免疫组织化学染色

石蜡切片常规脱蜡水化，微波修复。0.01 M PBS 冲洗5 min ×3 次;滴加3%H2O2室温10 min;PBS 冲洗5 min×3 次;滴加正常非免疫动物血清，常温10 min;滴加兔抗小鼠多克隆caspase－9 抗体(1∶100)，4 °C 过夜;PBS 冲洗5 min×3 次;山羊抗兔IgG (1∶200)，室温孵育10 min;PBS 冲洗5 min×3 次;链霉素抗生物素—过氧化物酶室温孵育10 min;PBS 冲洗5 min×3 次;DAB 显色3～10 min，苏木精复染细胞核，常规脱水、透明、封片，光镜下观察。用正常非免疫动物血清代替一抗作为阴性对照。

1.4 免疫印迹检测

脊髓称重后按1∶5 的比例加入0.9%NaCl 溶液，于冰上剪碎样品，4 ℃低温离心，弃上清，按1∶5 比例加入蛋白裂解液，超声粉碎，4 ℃裂解过夜，4 ℃低温离心30 min，取上清，考马斯亮蓝法进行蛋白定量。样品水浴煮沸5 min 后进行10%SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳，浓缩胶电压为90 V，分离胶转为110 V。转膜、3%牛血清封闭3 h 后加入一抗稀释液(兔抗小鼠多克隆抗体，caspase－91∶200)4 ℃过夜，辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(1∶5000)室温下孵育2 h。用ECL 发光试剂盒显像。

1.5 图像分析与统计学处理

2 结 果

2.1 免疫组织化学染色结果

Caspase－9 免疫组织化学阳性反应产物为棕褐色颗粒状，主要表达在小鼠脊髓后角浅层神经元的细胞质中。其中，对照组(Con 组)脊髓后角有少量Caspase－9 阳性反应产物。与Con 组相比较，其它3 组模型动物脊髓后角浅层的阳性反应产物均显著增多;其中，L－CAP 组的阳性反应产物最密集;H－CAP 组的阳性反应产物最稀疏(图1)。

2.2 图像分析结果

图像分析显示，与对照组(Con 组)比较，其它三组的光密度值显著增高(P ﹤0.01)，其中，L－CAP 组的光密度值最高(P ﹤0.01)，H－CAP组的光密度值最低(P ﹤0.01)(图2)。

2.3 免疫印迹结果

经免疫印迹显影后，可确认有Caspase－9 蛋白条带。图像分析显示:与对照组(Con 组)相比较，其它三组的Caspase－9 蛋白表达均显著增高(P ﹤0.01)。其中，L－CAP 组的表达最高，H－CAP 组的表达最低(P ﹤0.01)(图3)。

3 讨 论

神经病理性疼痛是由中枢或外周神经系统损伤而引起的不愉快感觉和情绪体验，即通常所指的慢性疼痛。创伤、代谢性疾病、肿瘤化疗、手术、射线、神经毒性药物、神经受压缺血、炎症和肿瘤的侵袭都可引起神经性疼痛［6］。它与急性疼痛不同，表现为自发性疼痛(针刺、电灼、撕裂、刀割样疼痛)和诱发性疼痛(即感觉异常和痛觉过敏)，可以持续存在，对机体无益，甚至会严重影响生活质量。

研究发现，NPP 的发病机制复杂，分为中枢机制与外周机制。其中，神经损伤可引起PKC 激活，后者促使转录因子环磷腺苷反应元件结合蛋白激活，调节即刻早期基因c－fos 和c－Jun 的转录和表达，从而激活其下游的c－Jun 激酶，引起脊髓表层神经元和中间抑制性神经元的凋亡，这也是脊髓敏化形成的重要因素。天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶家族(caspase)是细胞凋亡的分子机制中重要的效应因子，其中caspase－ 9 作为起始caspase，它能感受上游凋亡信号，引起下游caspase 活化，参与由细胞色素－C 激活的内源性细胞凋亡途径，从而最终激活下游的效应因子caspase－3、7，使细胞骨架蛋白和细胞修复酶等靶蛋白裂解，发生细胞凋亡［7］。傅［4］25－28等发现，大鼠足底皮下注射福尔马林能导致脊髓后角神经元凋亡。胡［8］等发现，慢性坐骨神经压迫性损伤可以引起大鼠脊髓后角凋亡神经元数量显著增多。本研究结果与上述结果相符，足底注射辣椒素后，小鼠脊髓后角浅层caspase－9 的表达显著增高，光密度值增多;免疫印迹分析也显示caspase－9 蛋白表达增多。

近年来的研究显示，微量元素锌可能与NPP的产生与传递有着密不可分的关系。据相关报导［9－10］，锌离子能影响非NMDA 受体的表达与功能，而这个受体在伤害性刺激传导过程中起着非常重要的作用。Jo 等［11］将动物的脊神经背根切断，用金属自显影技术发现在脊髓背侧角的浅层，锌离子的分布显著减少，同时伴随小鼠机械痛阈值的降低，小鼠出现痛觉过敏现象，推断锌可能参与了痛觉的传导。本研究应用免疫组织化学技术、免疫印迹技术和图像分析技术发现，高锌预处理可以使辣椒素致痛模型小鼠脊髓后角浅层的caspase－9 蛋白表达减少，光密度值降低;而低锌预处理能使caspase－9 的表达增多，光密度值增高，提示锌能抑制NPP 模型动物脊髓后角神经元凋亡。

本研究利用免疫组织化学技术、免疫印迹技术和图像分析技术分析了锌预处理对辣椒素致痛模型小鼠脊髓后角浅层caspase－9 蛋白表达的影响，结果发现足底注射辣椒素后，脊髓后角浅层caspase－9 的表达显著增多，高锌预处理使caspase－9 的表达上调，低锌预处理使蛋白表达下调，提示锌可能抑制了模型动物脊髓后角caspase－9 的表达，从而抑制了神经元的凋亡，但是其具体的抑制机制还需要进行深入的研究。

图1 免疫组织化学染色显示caspase－9 在各组模型动物脊髓的分布，×400

图2 各组小鼠脊髓的光密度值(caspase－9 免疫组化染色图像分析，，n=6)

图3 免疫印迹检测caspase－9 在各组小鼠脊髓的表达(，n=6)

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