赵振东，李嘉诚，冯玉红，孟晓静，金彪

(海南大学材料与化工学院，海口 570228)

超高效液相色谱-串联质谱法鉴别十字花科植物中硫代葡萄糖苷＊

赵振东，李嘉诚，冯玉红，孟晓静，金彪

(海南大学材料与化工学院，海口 570228)

建立超高效液相色谱-串联质谱法鉴别十字花科植物中硫代葡萄糖苷的分析方法。采用70%甲醇水溶液提取白芥种子中的硫代葡萄糖苷，通过反相C18柱分离，电喷雾-离子阱-飞行时间质谱测定。利用硫代葡萄糖苷二级质谱裂解产生的m/z 195，241，259，275，291特征离子和伴随产生的80，162，163，196，242 Da中性分子丢失规律，共鉴别出5种硫代葡萄糖苷。

硫代葡萄糖苷；十字花科；液相色谱；质谱

硫代葡萄糖苷(简称硫苷)是广泛存在于十字花科植物中的含硫次级代谢产物，主要分布于植物的根、茎和叶中。当植物细胞受到破坏(如挤压、虫咬等)后，硫苷与植物内生的黑芥子酶接触，降解产生异硫氰酸酯、恶唑烷酮和硫氰酸酯等化合物［1］，其中异硫氰酸酯具有良好的生物活性，而且对人畜无害。因此硫苷及其降解产物的研究引起了科学工作者的浓厚兴趣。根据侧链R基团的不同，目前已发现约120种硫苷，其中有多种具有抗癌、抗肿瘤、杀菌和杀虫活性的异硫氰酸酯，如吴华等［2］比较几种异硫氰酸酯的杀线虫活性，发现烯丙基和丙烯酰基异硫氰酸酯具有良好的杀线虫活性。大量研究表明甲硫基己基异硫氰酸酯等具有良好的抗肿瘤活性，是非常具有潜力的抗癌药物［3-6］。

硫苷的检测方法主要是传统的化学方法和现代的仪器分析手段。化学方法耗时、误差大、操作繁琐，只能测定硫苷总量。液相色谱法具有很高的分离效率，但对于硫苷单体鉴别需要对照品，无法满足快速鉴别硫苷的需要。笔者采用超高效液相色谱-离子阱-飞行时间质谱联用技术，既能高效分离硫苷，又能准确、快速鉴别硫苷。对于硫苷及降解产物的研究具有重要意义，同时又能够提高工作效率。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

超高效液相色谱-离子阱-飞行时间质谱仪：LCMS-IT-TOF型，日本岛津公司；

数显恒温水浴锅：HH-6型，常州澳华仪器有限公司；

真空干燥箱：VD23型，德国BINDER公司；电子天平：AUY220型，日本岛津公司；

超声波清洗器：KS-120EI型，宁波海曙科生超声设备有限公司；

旋转蒸发仪：R-216型，瑞士BUCHI公司；台式高速离心机：H-1650型，长沙湘仪离心机仪器有限公司；

研磨机：A11基本型，德国IKA公司；

白芥种子：产地为湖北武汉；

正己烷、氯仿、乙酸铵、甲酸：分析纯，广州化学试剂厂；

甲醇：色谱纯，美国Fisher公司；

实验用水为美国Pall公司Purelab Ultra超纯水系统制备的超纯水，电阻率为18.2 MΩ·cm。

1.2 硫代葡萄糖苷提取［7-8］

白芥种子在105℃干燥3 h，以灭活黑芥子酶保护硫苷。干燥种子经粉碎后，过420 μm筛。称取粗粉约50 g于锥形瓶中，依次用正己烷50 mL，氯仿50 mL 各3次除脂。残渣经真空干燥，用300 mL沸腾的70%甲醇水溶液浸泡，超声提取30 min，连续2次，合并提取液，静置至室温。提取液经离心分离，将清液真空下浓缩至原体积的20%。取1 mL浓缩液经石墨化碳脱色，滤液供超高效液相色谱-串联质谱分析。

1.3 流动相配制

用电子天平准确称量乙酸铵0.385 g，置于1 L量瓶中，加入1 mL甲酸，用水溶解定容后，经0.22 μm微膜过滤，超声波脱气后使用。

1.4 液质联用分析条件

（1）UPLC条件

ODS C18柱(100 mm×2.1 mm，3.5 μm，日本岛津公司)；柱温：30℃；流动相A：5 mmol/L乙酸铵-1‰甲酸溶液；流动相B：甲醇；流动相流速：0.2 mL/min；进样体积：20 μL；梯度洗脱：0～3 min，98% A；3～25 min，98%～20% A；25～30 min，20%～20 % A；30～35 min，20%～98% A。

（2）MS条件

ESI负离子模式；电压：-3.5 kV；雾化气：N2，流量为1.5 L/min；干燥气压力：100 kPa；碰撞气：Ar；检测器电压：1.7 kV；Heat Block温度：200℃；CDL温度：200℃；一级质谱扫描范围：m/z 300～700；母离子扫描范围：m/z 315～650；二级质谱扫描范围：m/z 50～700；离子累积时间：10 ms；CID碰撞能量：100%；碰撞气能量：100%。

2 结果与讨论

2.1 分析条件选择

硫苷在水溶液中是亲水性阴离子化合物，在反相色谱柱中，保留时间短。优化实验发现，在ODS-C18柱上采用流动相A(5 mmol/L的乙酸铵+0.1%甲酸)和流动相B(甲醇)能够很好分离，并且有很好的质谱响应。质谱Heat Block和CDL温度采用200℃，温度过高会造成硫苷裂解，过低则影响离子化和脱溶剂化效果。为获得比较丰富的二级离子碎片信息，CID碰撞能量和碰撞气能量均采用100%。

2.2 分析结果

按照1.4分析条件检测白芥种子提取液，获取硫苷提取离子流色谱图及其一、二级质谱图(见图1～图11)。根据裂解机理，并参考文献［9-12］，共鉴定出5种硫苷，结果见表1。

图1 白芥种子中硫代葡萄糖苷的提取离子流色谱图

图2 progoitrin一级质谱图(MS1)

图3 progoitrin二级质谱图(MS2)

图4 Sinigrin一级质谱图(MS1)

图5 Sinigrin二级质谱图(MS2)

图6 Gluconapin一级质谱图(MS1)

图7 Gluconapin二级质谱图(MS2)

图8 Glucobrassicanapin一级质谱图(MS1)

图9 Glucobrassicanapin二级质谱图(MS2)

图10 Gluconasturtiin一级质谱图(MS1)

图11 Gluconasturtiin二级质谱图(MS2)

2.3 质谱碎片离子裂解机理

二级质谱特征离子，对于鉴别硫苷具有重要意义。在MS2中，母离子先后失去SO3(80 Da)和C6H10O5(162 Da)后产生242 Da中性分子丢失，氢重排后出现相对应的R—C(SH)=N—O—离子。另一裂解途径是硫苷上的氢发生重排后，失去C6H11O5(163 Da)和C6H12O5S(196 Da)中性碎片。与此同时，二级质谱中还能观察到m/z 195，241，259，275，291的特征离子，这些离子是由于硫与相邻碳原子发生断裂，并伴有氢重排形成的。

硫代葡萄糖苷负离子模式下主要特征二级碎片离子裂解机理见图12［13-14］。

3 结语

利用液相色谱-串联质谱技术快速、高效、准确的分离与鉴定十字花科植物中硫代葡萄糖苷，对硫代葡萄糖苷二级质谱80，162，163，196，242 Da中性分子丢失和m/z 195，241，259，275，291特征离子裂解机理进行了阐述和总结，能够准确推测硫代葡萄糖苷化学结构，对于十字花科植物的开发与利用具有重要意义。

［1］Luca Lazzeri，Giovanna Curto，Onofrio Leoni，et al. Effects of glucosinolates and their enzymatic hydrolysis products via myrosinase on the root-knot nematode meloidogyne incognita (kofoid et white)chitw［J］. J Agric Food Chem，2004，52: 6 703-6 707.

表1 白芥种子中硫苷主要二级质谱离子表

图12 硫代葡萄糖苷质谱裂解规律示意图

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Separation and Identification of Glucosinolates in the Cruciferae Crops by UPLC-MS/MS

Zhao Zhendong，Li Jiacheng，Feng Yuhong，Meng Xiaojing，Jin Biao
(Materials and Chemical Engineering of Hainan University，Haikou 570228, China)

A method for precise identification of glucosinolates in the Cruciferae Crops by UPLC-MS/MS was established. The glucosinolates were extracted with methanol-water (volume ratio 70∶30)，while the separation and qualitative determination of the individual glucosinolates was achieved using RP-UPLC-ESI-IT-TOF. The glucosinolates was confirmed with the use of product ions at m/z 195，241，259，275，291 in MS2. Further identification of the five glucosinolates was based on the detection of compounds with a constant neutral loss of 80, 162, 163, 196, 242 Da in collision-induced dissociation.

glucosinolate; cruciferae; liquid chromatography; mass spectrometry

O657.63

A

1008-6145(2013)02-0012-04

10.3969/j.issn.1008-6145.2013.02.003

*“十二五”科技支撑计划（2011BAE06B06-7，2011BAE06B04-7）；海南大学青年基金项目（qnjj1220）

联系人：冯玉红；E-mail: ljcfyh@263.net

2012-12-12