（中国医科大学法医学院，辽宁 沈阳 110001）

5-羟色胺（5-hydroxytrptamine，5-HT）是重要的单胺类中枢神经递质，参与多种中枢神经活动。研究证明5-HT的功能紊乱与多种精神疾病相关[1-4]。色氨酸羟化酶（tryptophan hydroxylase，TPH）是 5-HT 合成的第一个也是唯一的限速酶，因此，TPH基因表达正常与否直接影响5-HT的合成量，进而影响其在中枢神经系统的功能[5]。过去一直认为TPH来源于单基因（现在指 TPH1），直到 2003 年，Walther等[6]发现第二种TPH亚型——TPH2。人类TPH2基因位于12q21.1，全长93.5kb，包含11个外显子。TPH2主要在脑干表达，负责中枢5-HT的合成，因而TPH2基因也成为与5-HT功能紊乱相关的精神疾病遗传学研究中的一个重要的候选基因。

本研究拟通过直接测序的方法调查TPH2基因5′、3′端遗传多态性在中国北方汉族群体的分布情况，为相关疾病分析提供遗传学参数，同时探讨其法医学意义。

1 材料与方法

1.1 实验样品

244例中国北方汉族无血缘关系健康个体肘静脉血液样品，由中国医科大学法医学院提供。枸橼酸钠抗凝、酚-氯仿有机溶剂提取法提取白细胞的基因组DNA。

1.2 PCR扩增与测序

设计并合成两对特异性引物，分别扩增TPH2基因 5′端 905bp和 3′端 1104bp的两个目的片段。5′端上游引物序列为 5′-TGCATAGAGGCATCACAGGA-3′，下游引物序列为 5′-AGCAGGGGGTACTAGAGGG-3′；3′端上游引物序列为 5′-ATTACCCGTCCCTTCTCA-3′，下游引物序列为 5′-CAAGCACTGGGACGAAT-3′。 扩增体系20 μL，其中包括LA-Taq DNA聚合酶（大连宝生物工程有限公司）0.2μL（1U）、10×缓冲液 2μL、dNTP 1.6 μL、DNA 模板 2 μL（5～10 ng）、上下游引物各 1.6μL（0.5pmol/μL）、去离子水 11μL。PCR 反应在T-Gradient梯度PCR仪（德国Biometra公司）上进行。5′端目的片段热循环条件为94℃ 1min；94℃ 1min，67℃ 40s，72℃ 1min，33 个循环；72℃ 2min。3′端目的片段热循环条件为94℃ 1 min；94℃ 1 min，64℃40s，72℃ 1min，33 个循环；72℃ 2min。

PCR产物经纯化后应用原PCR扩增引物在3130遗传分析仪（美国AB公司）上进行双向测序分析。

1.3 数据统计

根据测序结果运用直接计数法计算基因型频率和等位基因频率，并进行Hardy-Weinberg平衡检验。按 Odelberg 法计算杂合度（H）、个体识别率（DP）、非父排除率（PE）和多态信息含量（PIC）。按 Nei和ChaKraborty法计算杂合度。应用Halpoview v4.2软件进行连锁不平衡分析。

2 结果与讨论

2.1 TPH2基因5′和3′端SNP位点检测结果

244例中国北方汉族个体测序结果显示除已报道的 rs4570625（－703G/T）、rs11178997（－473T/A）、rs11178998（90A/G）、rs41317118（92999G/A）、rs17110747（93329G/A）和 rs41317114（93724G/C）6个SNP位点外，在92922位点检测到1例C/T变异（表1，图1），由于其等位基因频率小于1%，因此考虑为突变。另外，在92999G/A位点未检出AA基因型，说明该基因型在中国北方汉族群体比较少见。

表1 TPH2基因5′、3′端变异位点检测结果

图1 TPH2基因92922C/T位点杂合子序列分析图

2.2 TPH2基因5′、3′端SNP位点多态性调查结果

TPH2基因6个SNP位点基因型频率、等位基因频率见表2，经χ2检验，6个SNP位点基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律（P>0.05）。

表2 中国北方汉族群体TPH2基因6个SNP位点基因型频率、等位基因频率 （%）

2.3 TPH2基因5′、3′端SNP位点连锁不平衡分析

应用Halpoview v4.2软件对TPH2基因6个SNP位点进行连锁不平衡分析，结果显示，5′端3个SNP位点之间和3′端3个SNP位点之间存在紧密连锁（图2）。因此，确定两个单倍型分区分别为Block1和Block2。相应的单倍型频率和基因型频率见表3。

2.4 TPH2基因5′、3′端SNP位点的群体遗传学参数

根据TPH2基因5′、3′端SNP位点在中国北方汉族群体的遗传多态性分布情况，计算各位点的群体遗传学参数，结果见表4。其中－703G/T、93329G/A和5′、3′端SNP位点分别构成的单倍型均具有较高的个体识别率和非父排除率。

图2 TPH2基因5′、3′端SNP位点连锁不平衡示意图

表3 中国北方汉族群体TPH2基因5′、3′端SNP位点分别构成的单倍型和基因型频率

表4 TPH2基因5′、3′端SNP位点及单倍型的群体遗传学参数 （n=244）

3 讨 论

3.1 TPH2基因 5′、3′端 SNP位点在中国北方汉族群体的分布情况

SNP是继DNA指纹图、微卫星之后的第三代遗传标记，作为全新一代遗传标记具有分布广、多态信息含量丰富、突变率低、易于判型、适于快速高流量检测等特点，目前成为医学、法医学领域等研究的热点。

本研究采用直接测序的方法调查TPH2基因5′、3′端SNP位点在中国北方汉族群体的分布情况。根据测序结果，共检测到7个变异位点，其中6个位点具有遗传多态性，分别为 rs4570625（－703G/T）、rs11178997（－473T/A）、rs11178998（90A/G）、rs41317118（92999 G/A）、rs17110747（93329G/A）和 rs41317114（93724 G/C）。 rs11178997、rs41317114 为转换，rs4570625、rs11178998、rs41317118、rs17110747 为颠换。上述 6 个SNP位点均位于TPH2基因的调控区，包括启动区、非翻译区及侧翼序列，因此不会改变蛋白质序列，但可能会参与基因表达的调节。在92922C/T位点的变异仅在1例样本中检出，说明该位点在中国北方汉族群体不具有遗传多态性。另外，在rs41317118位点未检出AA基因型，说明该基因型在中国北方汉族群体比较少见。通过连锁分析发现，6个SNP位点连锁不平衡系数 D’绝对值介于 0.02～1.0，其中 rs4570625、rs11178997、rs11178998位点相互之间和rs41317118、rs17110747和rs41317114位点相互之间的D’值均为1.0，说明上述位点之间紧密连锁。

根据TPH2基因5′、3′端SNP位点在中国北方汉族群体的分布情况，经Halpoview v4.2软件计算，TPH2基因5′端的3个SNP位点共构成4种单倍型，分别为TTA、GTA、TAG和GAG，但单倍型GAG的频率小于1%，因此推测TPH2基因5′端SNP位点主要构成3种单倍型，这与Scheuch等[7]报道一致。TPH2基因3′端的3个SNP位点共构成4种单倍型，分别为 GGG、GAG、GGC、AAG。

本实验获得的中国北方汉族群体TPH2基因5′、3′端SNP位点的等位基因频率、基因型频率以及单倍型频率，并对相关疾病的关联分析提供了基础数据。

3.2 TPH2基因 5′、3′端 SNP 位点的法医学意义

根据TPH2基因5′、3′端6个SNP位点在中国北方汉族群体的分布情况，计算出各位点及其单倍型的杂合度、多态信息含量、个体识别率及非父排除率。其中rs4570625位点的个体识别率为0.616、非父排除率为0.148，rs17110747位点的个体识别率为0.557、非父排除率为0.112，5′端3个SNP位点构成的单倍型的个体识别率为0.792、非父排除率为0.252，3′端3个SNP位点构成的单倍型的个体识别率为0.752、非父排除率0.239，说明上述两个位点和两种单倍型均具有较高的个体识别率和非父排除率，可用于法医学个体识别和亲子鉴定。

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