励 娜，胡 荣，蒋成英，杨荣平，张小梅

重庆市中药研究院，重庆400065

丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhizaBge．的干燥根及根茎。性微寒味苦，具有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦、凉血消痈的功效。用于胸痹心痛、脘腹胁痛、癥瘕积聚、热痹疼痛、心烦不眠、月经不调、痛经经闭、疮疡肿痛［1］。丹参药材中主要含脂溶性和水溶性成分。其中水溶性成分主要为丹酚酸类化合物，如丹参素、丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸C、迷迭香酸等，具有改善微循环、抗血栓、促进组织恢复等作用。现代医学认为，丹参酚酸类成分能够缩小心肌梗死的范围，减轻其病情，对大鼠心肌缺血、再灌注损伤具有保护作用，同时有明显的抑制血小板聚集、抗凝、溶纤及降低血脂、抗动脉粥样硬化的作用［2］。

《中国药典》2010年版(一部)丹参项下收载用HPLC法测定丹酚酸B的含量标准，测定时间在20 min以上，只能测定丹酚酸B单一组分的含量，不利于丹参药材水提物的整体质量控制。本实验应用硝酸铝络合显色原理，采用紫外分光光度法测定丹参提取物中酚酸类的含量，并对方法的可行性进行了验证。结果表明该含量测定方法简便、快捷、准确，大大缩短了丹酚酸含量测定时间，提高了丹参药材质量检测的效率，为丹参药材及其水提物质量控制提供了有效方法。

1 仪器与材料

UV-1601紫外-可见分光光度计(日本岛津公司);BUG25-12超声波清洗机［220 W，50 KHz，必能信超声(上海)有限公司］;数显恒温水浴锅(上海梅香仪器有限公司);AEG-45SM电子天平(十万分之一，日本岛津公司);BP121S电子天平(万分之一，北京赛多利斯科学仪器有限公司)。丹参药材提取物(南京泽朗医药科技有限公司提供，批号:090927);丹酚酸B对照品(南京泽朗医药科技有限公司提供，批号:115939-258A0056)。试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2．1 对照品溶液与供试品溶液的制备

2．1．1 对照品溶液的制备

称取丹酚酸B对照品1．6 mg，置于10 mL容量瓶中，精密称定，加入75%甲醇溶解并定容至刻度。即得每1 mL含0．16 mg的丹酚酸B对照品溶液。

2．1．2 供试品溶液的制备

取丹参提取物粉末约0．02 g，精密称定，加沸水使溶解，冷却后定容于25 mL容量瓶，摇匀，作供试品溶液。

2．2 测定波长的选择

取对照品溶液和供试品溶液5 mL，分别置于25 mL量瓶中，顺序加入 5%NaNO23 mL、10%Al(NO3)30．5 mL、NaOH 试液 15 mL，加水至刻度，摇匀，放置5 min后，在400～800 nm波长范围内扫描，二者在482 nm有最大吸收，故选择482 nm为测定波长。

2．3 分光光度法条件筛选

2．3．1 5%NaNO2用量考察

取供试品溶液各5 mL，置于25 mL量瓶中，分别加入 5%NaNO20、1、3、5、10、13 mL，再加入 10%Al(NO3)30．5 mL和NaOH试液5 mL，加水至刻度，摇匀，放置5 min后，在482 nm波长处测定其吸光度分别为 0．074、0．330、0．441、0．398、0．438、0．432。结果表明，5%NaNO2用量在3 mL时样品吸光度较高，故5%NaNO2用量选择在3 mL为宜。

2．3．2 10%Al(NO3)3用量考察

取供试品溶液各5 mL，置于25 mL量瓶中，加入5%NaNO23 mL后，分别加入10%Al(NO3)30、0.1、0．5、1、3 mL，再加入 NaOH 试液 5 mL，加水至刻度，摇匀，放置5 min后，在482 nm波长处测定其吸光度分别为 0．065、0．431、0．469、0．522、0．511、0.478。结果表明，10%Al(NO3)3用量在0．5 mL时样品吸光度较高，故10%Al(NO3)3用量选择在0．5 mL为宜。

2．3．3 NaOH 试液用量考察

取供试品溶液各5 mL，置于25 mL量瓶中，加入5%NaNO23 mL、10%Al(NO3)30．5 mL 后，分别加入 NaOH 试液0、1、5、10、15 、16 mL，加水至刻度，摇匀，放置5 min后，在482 nm波长处测定其吸光度分别为 0．164、0．358、0．496、0．511、0．550、0．551。结果表明，NaOH试液用量在15 mL和16 mL时样品吸光度均较高，同时吸光度值相差不大，故NaOH试液用量选择在15 mL为宜。

2．3．4 显色时间的考察

取供试品溶液5 mL，置于25 mL量瓶中，加入5%NaNO23 mL、10%Al(NO3)30．5mL 和 NaOH 试液15 mL，加水至刻度，摇匀，分别在 0、3、5、10、20、30 min后，在482 nm波长处测定其吸光度分别为0.522、0．522、0.521、0．517、0．515、0．514。结果表明，在放置5 min内吸光度值较高且稳定，5 min后吸光度值开始下降较明显，故选择的显色时间为5 min。

2．4 线性关系考察

精密移取对照品溶液 0．5、1、2、4、6、6．5 mL，分别置于25 mL量瓶中，顺序加入5%NaNO23 mL、10%Al(NO3)30．5 mL、NaOH 试液 15 mL，加水至刻度，摇匀，放置5 min后，于482 nm波长下测定吸光度。以丹酚酸B的浓度(mg/mL)为横坐标(X)、吸光度值为纵坐标(Y)，进行回归，回归方程为Y=0.8071X+0．0427(r=0．9977)。结果表明，丹酚酸B含量在0．0782～1.0166 mg范围内，吸光度值与含量线性关系良好。

2．5 精密度实验

精密吸取丹酚酸B对照品溶液(0．16 mg/mL)5 mL于25 mL容量瓶中，按2．4中显色条件操作，经放置显色后，于482 nm波长处测定吸光度，连续6次，RSD值为0．009%，表明仪器精密度较好。

2．6 稳定性实验

2．6．1 对照品稳定性试验

精密吸取丹酚酸B对照品溶液(0．16 mg/mL)5 mL于25 mL容量瓶中，按2．4中显色条件显色后，分别在 0、0．5、1、1．5、3、4、8、12、24 h 测定其在 482 nm波长处的吸光度。吸光度平均值为0．668，RSD值为1.57%。结果表明，对照品溶液在24 h内较稳定。

2．6．2 样品稳定性试验

取丹参提取物粉末约0．02 g，精密称定，按2.1．2项下制得供试品溶液，取供试品溶液5 mL，按2．4 中显色条件显色后，分别在 0、0．5、1、1．5、3、4、8、12、24 h测定其在482 nm波长处的吸收度。样品24 h内总酚酸含量平均值为19．553%，RSD值为3.26%;12 h内丹酚酸含量平均值为19．718%，RSD值为1．66%，表明供试品溶液在显色后12 h内基本稳定。

2．7 重现性实验

取丹参提取物粉末约0．025 g，精密称定，5份，按2．1．2项下制得供试品溶液，分别取供试液5 mL，按2.4中显色条件显色后，测定其在482 nm波长处的吸收度。计算丹酚酸的含量平均值为19.416%，RSD值为1．18%，表明实验重现性良好。

2．8 回收率试验

精密称取已知含量的丹参提取物6份，精密称定。按样品中丹酚酸含量的80%、100%、120%精密加入对照品，按2．1．2项下制得供试品溶液，分别取供试液5 mL，按2．4中显色条件显色后，测定其在482 nm波长处的吸收度。计算回收率为101.652%，RSD值为0．81%，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果(n=9)Table 1 Results of recovery test(n=9)

2．9 样品的含量测定

按拟定含量测定方法对丹参药材提取物3批样品进行检验，结果见表2。

表2 3批样品中含量测定结果Table 2 Content of salvianolic acid determined in 3 batches’sample

3 讨论

本实验测定法较用HPLC法测定丹酚酸B单一成分含量更快速、简便，同时对丹参药材水溶性大类成分的控制也更为准确、可靠。同时，可根据本实验方法及结果，将显色剂组合开发为测定试纸等快速测定用产品，用于含邻二酚羟基的酚酸类化合物的测定。对药材的种植、加工、炮制等各个环节的质量控制具有非常重要的开发利用价值。

丹参药材中酚酸类成分含量约为10%～13%［3］，而本实验测定含量在19% ～20%，原因在于本实验测定的是丹参水溶提取物中酚酸类成分的含量，理应比丹参药材中酚酸类成分的含量高，实验目的在于考察方法的可行性。

丹酚酸类成分受热见光均不稳定、易氧化，故样品制备好后应及时检测。同时，应注意样品的避光低温保存。

本法简便、准确，重现性良好，可用于丹参药材及提取物的质量控制。

1 Chinese Pharmacopoeia Commission(国家药典委员会)．Pharmacopoeia of the People’s Republic of China(中华人民共和国药典)．Beijing:China Medical Science Press，2010，Vol I．70．

2 Gao X(高霞)，Wang ZM(王著明)，Wen SJ(温守俭)．Different water extraction and alcohol precipitation process for the purification of salvianolic acid process．Jilin Med J(吉林医学)，2009，30:614-615．

3 Ye Y(叶勇)．Comparative study on determination of salvianolic acids content by colorimetery and HPLC．J Zhejiang Univ Tradit Chin Med(浙江中医药大学学报)，2006，30:350-351．